A história da realização de um Pós-Doutorado na Cornell University, Nova Iorque (13)

O Projeto de Pesquisa Experimental: “Absorção de Macromoléculas Intactas Pelo Jejuno De Ratos in vivo: Influência Dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato”

Discussão

A- O Típico Modelo da Enteropatia Ambiental
A presença das bactérias da flora colônica na luz do jejuno, ao superar os mecanismos fisiológicos existentes para seu controle em local adequado (íleo terminal e colon) como pode ocorrer em diversas situações clínicas, cujo exemplo mais marcante é o da Enteropatia Ambiental, provoca algumas anormalidades de forma direta e indireta.

As bactérias da flora colônica, em especial as anaeróbias, como por exemplo, Bacteróide e Veilonella, estando presentes na luz do intestino delgado alto passam a competir com o hospedeiro quanto ao melhor aproveitamento dos nutrientes da dieta, a saber: 1- Proteínas: as bactérias utilizam as proteínas da dieta para seu metabolismo próprio além da vitamina B12 e do ácido fólico, sendo que seus subprodutos são absorvidos pela mucosa intestinal e eliminados na urina sob a forma de Indican (Figura 1).

Figura 1- Representação esquemática da ação das bactérias sobre as proteinas e vitaminas da dieta.

2- Carboidratos: as bactérias utilizam os carboidratos da dieta para seu metabolismo próprio fermentando-os e transformando-os na luz do intestino delgado em ácidos orgânicos voláteis de cadeia pequena e média, tais como ácido láctico e acético. Estes ácidos orgânicos em parte serão absorvidos pela mucosa intestinal e serão eliminados pela respiração sob a forma de Hidrogênio, enquanto que outra parte permanece na luz do intestino e exerce importante efeito osmótico acarretando secreção de água desde o leito vascular para o interior do intestino provocando sintomas, tais como, diarréia, flatulência, distensão abdominal e cólicas (Figura 2).

Figura 2- Esquema da diarréia osmótica provocada pela má absorção dos carboidratos da dieta.

As bactérias podem também provocar alterações morfológicas nos enterócitos particularmente nas microvilosidades, região aonde se encontram as dissacaridases, enzimas responsáveis pela digestão dos dissacarídeos da dieta, levando à deficiência das mesmas. Pariticular importância refere-se à lactase, a mais vulnerável das dissacaridases, responsável pela digestão da lactose, o dissacarídeo encontrado praticamente apenas no leite. Naquelas crianças de tenra idade em que o leite representa um majoritário aporte nutricional, a deficiência de lactase pode resultar em efeitos colaterais dramáticos ocasionando diarréia crônica e importante agravo do estado nutricional (Figura 3);

Figura 3- Representação esquemática da ação das bactérias sobre as dissacaridases, em especial, sobre a lactase.

3- Gorduras: as bactérias podem atuar sobre os ácidos graxos das gorduras da dieta produzindo uma beta-hidroxilação dos mesmos. Este novo composto orgânico tem capacidade catártica e provoca irritação da mucosa colônica gerando diarréia (Figura 4).

Figura 4- Representação esquemática da ação das bactérias sobre os ácidos graxos componentes das gorduras da dieta, causando beta hidroxilação dos mesmos.

As bactérias colônicas podem provocar anormalidades na função digestivo-absortiva de forma indireta por sua atuação sobre os sais biliares primários, ácido cólico e quenodeoxicólico, desconjugando-os e 7 alfa desidroxilando-os e transformando-os em sais biliares secundários e desconjugados, ácido deoxicólico e ácido litocólico, os quais como já vimos anteriormente terão inúmeras ações lesivas morfo-funcionais sobre a mucosa do intestino delgado.

O clássico exemplo clínico desta situação fisiopatológica está bem caracterizado nos pacientes portadores de Enteropatia Ambiental. São crianças que vivem em ambientes promíscuos socialmente vulneráveis em comunidades desprovidas de água potável e saneamento básico com elevados níveis de contaminação ambiental, como é a típica situação de vida em nossas favelas (Figuras 5 & 6).

Figura 5- Uma favela brasileira, verdadeira fossa negra a céu aberto, e as crianças brincando nas águas contaminadas.



Figura 6- Uma típica favela brasileira, esta no nosso Nordeste.

Baseados nos achados desta investigação experimental, já de retorno ao Brasil, juntamente com meus estudantes de pós-graduação, nos dedicamos a um trabalho comunitário envolvendo crianças faveladas moradoras da favela Cidade Leonor, em São Paulo, aonde tivemos a oportunidade de confirmar os altos índices de desnutrição protéico-calórica (Figura 7), deficiente capacidade absortiva (Figura 8) e altas taxas de ocorrência de sobrecrescimento bacteriano no intestino delgado (Figura 9).

Figura 7- Classificação do estado nutricional das crianças por nosso grupo atendida na favela cidade Leonor.

Figura 8- Deficiência da absorção da D-xilose em crianças da favela cidade Leonor.

Figura 9- Sobrecrescimento bacteriano no intestino delgado em crianças da favela cidade Leonor.

Este projeto de investigação representa um clássico exemplo de como os conhecimentos adquiridos por meio da pesquisa básica, nas bancadas dos laboratórios, utilizando animais de experimentação, a partir da elaboração de um modelo que reproduz situações vivenciadas na prática clínica, pode desvendar as conseqüências íntimas de um sem número de mecanismos fisiopatológicos, e, consequentemente propiciar as propostas de medidas de prevenção e tratamento adequados.

Desdobramentos deste Projeto de Pesquisa
Vale salientar que os resultados preliminares deste trabalho foram pela primeira vez apresentados no Congresso da Federation of the American Society for Experimental Biology (FASEB), realizado em Atlantic City, Nova Jersey, em 1978 (Figura 10) e publicado na revista Federation Proceedings 12:433,1978 título: “Bile-salt-enhanced jejunal macromolecular absorption”, autores “Ulysses Fagundes-Neto, Saul Teichberg, Mary Ann Bayne, Fima Lifshitz”.

Figura 10- Nosso poster exposto no Congresso da FASEB em Atlantic City.

A versão completa deste trabalho foi apresentada como minha tese de Doutorado em Gastroenterologia na Escola Paulista de Medicina em 1979, com o título “Absorção de Macromoléculas Intactas pelo Jejuno de Ratos In Vivo: Influência dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato” tendo sido aprovada com nota 10,0 (dez). Posteriormente este trabalho foi publicado na revista Journal of Laboratory Investigation 44:18-26,1981, título: “Bile-salt-enhaced rat jejunal absorption of a macromolecular tracer”, autores: “Ulysses Fagundes-Neto, Saul Teichberg, Mary Ann Bayne, Fima Lifshitz”.
Além deste projeto de pesquisa experimental, baseando-se nos mesmos princípios metodológicos e nas mesmas técnicas, mas variando o modelo animal 2 outros trabalhos foram desenvolvidos neste período de Pos-Doc no laboratório de Pediatric Research, no North Shore University Hospital, os quais também estão publicados na literatura médica internacional. O primeiro deles refere-se às mesmas condições metodológicas, porém, desenvolvido em modelo de indução de desnutrição protéico-calórica em ratos e o segundo em ratos desmamados submetidos à dieta crônica com lactose, a saber: American Journal of Clinical Nutrition 343:1281-91,1981, título “Jejunal macromolecular absorption and bile-salt deconjugation in malnourished rats”, autores “Ulysses Fagundes-Neto, Saul Teichberg, Mary Ann Bayne, Fima Lifshitz” e Pediatric Research 17:381-39,1983, título “Disaccharide feedings enhace rat jejunal macromolecular absorption”, autores “Ulysses Fagundes-Neto, Saul Teichberg, Mary Ann Bayne, Raul Wapnir, Fima Lifshitz”, respectivamente.
Considerações Finais
Ao cabo da jornada pude finalmente responder todas aquelas questões que insistiam em me atormentar antes de tomar a decisão definitiva de aceitar o convite para trabalhar nos Estados Unidos. O local aonde vivíamos era perfeitamente adequado para uma família que lá estaria em caráter temporário, e, além disso, se encontrava a exatos 5 minutos de caminhada até o hospital; tive a oportunidade, no hospital, além de desenvolver minhas atividades de pesquisa experimental, atender pacientes e travar conhecimento com enfermidades pouco comuns em nosso país naquela época, portanto, não me afastei da prática clínica o que tanto me preocupava; rapidamente me adaptei às novas funções de investigador de bancada graças principalmente, além de um grande esforço pessoal, por ter encontrado uma companheira de trabalho maravilhosa que foi Mary Ann Bayne, que pacientemente me ensinou todos os truques e técnicas necessárias para desenvolver os trabalhos de investigação; além dela encontrei em Saul Teichberg, um grande amigo, sempre disposto a me ensinar os detalhes das preparações histológicas e os meandros da Biologia Celular, bem como compartilhar comigo as emoções das novas descobertas científicas que nosso projeto revelava; no campo pessoal sentia-me muito feliz por estar fazendo algo inteiramente inédito na minha carreira e obtendo resultados positivos, meu foco de trabalho era essencialmente o projeto de pesquisa, não tinha que desempenhar outras tarefas que pudessem dispersar meus pensamentos, e nem tampouco outras preocupações quer sejam profissionais ou pessoais; no campo familiar tudo era extremamente tranqüilo sem sobressaltos, a vida nos Estados Unidos era absolutamente estável, não havia inflação como no Brasil naqueles anos, tudo era perfeitamente planejável a médio e longo prazo, o valor do dinheiro não sofria oscilações, não havia quaisquer problemas de segurança, todos podiam se deslocar para qualquer lugar sem que houvesse sobressaltos, havia plena liberdade de expressão coisa que no Brasil não existia (estávamos ainda sob a vigência da ditadura), podíamos desfrutar de inúmeras atividades culturais e de lazer a preços módicos, enfim, havia todo um conjunto de fatores que propiciava o desfrutar de uma vida acomodada; nos fins de semana podíamos passear nos parques públicos e muitas vezes assistir a concertos ao ar livre da Filarmônica de Nova Iorque tocando no Eisenhower Park (era nosso parque preferido) (Figuras 11 & 12) ou viajar e conhecer diferentes e maravilhosos lugares próximos ou mesmo distantes de Nova Iorque (Figuras 13 – 14 - 15 & 16) aproveitando, assim, esta oportunidade única de uma vida absolutamente descompromissada com o futuro material.

Figura 11- Juliana e Marina se divertindo em um fim de semana no play-ground do Eisenhower Park.

Figura 12- Um fim de semana no Eisenhower Park quando da minha participação de uma corrida de 6 milhas. Uly também correu 3 milhas e foi premiado como o mais jovem participante da prova.

Figura 13- A família em visita ao Cloister um castelo medieval trazido da Europa por um milionário americano e transplantado no norte de Manhatan.

Figura 14- Uly e as cerejeiras em flor no jardim japonês do jardim Botânico do Broolkyn. Elas florescem apenas uma vez ao ano e a floração dura apenas 15 dias.

Figura 15- Região das Thousand Islands, no lago Ontário, Canadá em uma das viagens de verão.

Figura 16- Uly, Juliana e Marina em um passeio de barco pelo lago Ontário na região das Thousand Islands.

Porém, a despeito de todos estes fatos, para quem tem raízes assentadas na sua terra natal e que tem desejos incontroláveis de ser um agente de transformação do status quo, esta situação confortável não satisfazia aos anseios dos nossos ideais, e as saudades das nossas coisas no Brasil sempre nos remetia ao país e o desejo de voltar era muito mais intenso do que o apelo para lá permanecer, e ser apenas um a mais naquela imensa multidão totalmente anônima. Por isso, o sentimento do retorno falou mais alto, e assim retornamos, e aqui pudemos exercer o papel de agente de transformação de forma plena, sem quaisquer arrependimentos. Valeu à pena a experiência, foi extraordinária sob todos os aspectos que se queira considerar, mas valeu ainda mais voltar ao nosso rincão, onde as raízes estão sólida e profundamente fincadas há muitas gerações.
Aqui termino a história de vida pessoal e profissional em Nova Iorque, mas antes é necessário enfatizar que na volta, logo após minha chegada enviei um projeto de pesquisa à FAPESP baseado em tudo aquilo que havia aprendido no meu Pos-Doc, e solicitei 2 bombas de perfusão, para poder transportar para cá o modelo de pesquisa que lá havia desenvolvido. O projeto foi aprovado as bombas de perfusão foram compradas, e, com esta aquisição pudemos implantar a técnica da perfusão intestinal em ratos em nosso meio. Inúmeros projetos de pesquisa passaram a ser realizados utilizando esta metodologia, o que resultou em uma ampla série de trabalhos de tese de Mestrado e Doutorado de alunos meus oriundos dos mais diferentes locais do país. Eu passei a ser um agente de transformação, conforme havia sonhado e planejado.
No nosso próximo encontro iniciarei um novo tema de grande interesse atual para a nossa especialidade.

A história da realização de um Pós-Doutorado na Cornell University, Nova Iorque (12)

O Projeto de Pesquisa Experimental: “Absorção de Macromoléculas Intactas Pelo Jejuno De Ratos in vivo: Influência Dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato”

Resultados

1. Análise Bioquímica da Absorção da Horse Radish Peroxidase (HRP)

A absorção de HRP mostrou-se significantemente mais elevada que os níveis observados para o grupo controle somente quando a solução de perfusão continha o sal biliar primário desconjugado (Cólico) e o sal biliar secundário e desconjugado (Deoxicólico). Outrossim, a absorção de HRP se revelou mais intensa ainda quando a solução de perfusão continha o sal biliar secundário e desconjugado. Não houve diferenças significativas nos níveis séricos da HRP entre os ratos controles perfundidos com solução glico-salina isenta de sais biliares e nos ratos perfundidos com o sal biliar primário e conjugado Taurocólico (fisiológico) (Tabela 1).

2. Microscopia Eletrônica de Transmissão

A penetração de HRP através do epitélio intestinal foi citoquimicamente demonstrável após a perfusão intestinal com o sal biliar primário desconjugado (Cólico) e com o sal biliar secundário desconjugado (Deoxicólico). Nestas preparações a HRP foi visualizada nos espaços intercelulares entre 2 enterócitos adjacentes (Figura 1), bem como ao longo de toda a região das microvilosidades, na zona terminal no interior de vesículas endocitóticas e corpos multivesiculares, ao longo da membrana basal das células epiteliais e nos capilares da lâmina própria (Figuras 2 & 3).

Figura 1- Ultramicrofotografia de 2 enterócitos adjacentes de uma preparação perfundida com DCh. O produto de reação da HRP (em negro) é encontrado sobre as microvilosidades (v) e no espaço intercelular (e). A mitocôndria (m) aparece morfologicamente intacta. No detalhe, Figura 1a, o produto de reação da HRP (negro) é encontrado ao longo de todo o espaço intercelular (e) inclusive com ruptura da zona da junção firme (t). Na Figura 1b o produto de reação da HRP (negro) preserva a região da junção firme.

Figura 2- Ultramicrofotografia de um enterócito de uma preparação perfundida com DCh. O produto de reação da HRP (negro) encontra-se sobre as microvilosidades, as quais estão diminuidas em altura e ao longo do espaço intercelular. Notar no detalhe que as mitocôndrias (m) e o aparelho de Gogi (g) encontram-se inchados e deformados.

Figura 3- Ultramicrofotografia de uma preparação perfundida com DCh. Notar no centro da foto uma estrutura bizarra arredondada com a presença no seu interior do produto de reação da HRP (negro). Trata-se de um corpo multivesicular que caracteriza a atividade lisosomal intracitoplasmática com destruição da macromolécula.

Em todas as preparações nas quais houve penetração da HRP na lâmina própria o marcador protéico também foi detectado no interior dos capilares. O endotélio capilar é fenestrado e a HRP foi visualizada no interior dos capilares venosos (Figura 4).

. Figura 4- Ultramicrofotografia de uma preparação perfundida com Ch. Nota-se o produto de reação da HRP (negro) no interior de um capilar venoso da lâmina própria (c), desde o espaça intercelular (e). Notar em (r) uma hemácia e em (f) um fibroblasto

Com o sal biliar primário e conjugado, Taurocólico, a absorção de HRP foi raramente demonstrada, pelo método citoquímico empregado, em apenas umas poucas vesículas endocitóticas e corpos multivesiculares; o marcador protéico manteve-se confinado às microvilosidades e ocasionalmente pode-se comprovar alguns depósitos focais do produto de reação da HRP nas regiões mais profundas dos espaços intercelulares (Figura 5). Os mesmos achados também foram observados no grupo controle.

Figura 5- Ultramicrofotografia de 2 enterócitos adjacentes de uma preparação perfundida com TCh. O produto de reação da HRP (negro) encontra-se inteiramente confinado na região das microvilosidades (v). Notar que o espaço intercelular (e) encontra-se praticamente desprovido do produto de reação da HRP e que as mitocôndrias (m) e os retículos endoplásmicos (r) encontram-se totalmente intactos e preservados.

Discussão

A- Mecanismos de Absorção da HRP Induzidos pelos Sais Biliares

O ponto central dos nossos experimentos refere-se ao fato de que modificações qualitativas e quantitativas dos sais biliares no micro-ambiente jejunal podem acarretar alterações significativas sobre a barreira de permeabilidade intestinal favorecendo a absorção de macromoléculas protéicas potencialmente alergênicas. Neste estudo ficou plenamente demonstrado que a presença de sais biliares desconjugados no lumem do intestino delgado alto provoca aumento da absorção de um marcador macromolecular. Mais ainda, demonstramos que a magnitude desta captação, ao que tudo indica, parece depender do tipo do sal biliar, primário ou secundário, e seu estado químico, conjugado ou desconjugado.

Baseando-se na experiência de Berrant e cols., que demonstraram em ratos, que na vigência de sobrecrescimento bacteriano da flora colônica no intestino delgado alto os valores dos sais biliares desconjugados alcançam concentrações de até 1 mM, as condições do nosso experimento encontram-se plenamente compatíveis com situações fisiopatológicas.

Os mecanismos íntimos envolvidos nesta absorção aumentada da HRP podem variar dependendo de cada sal biliar em particular e seu estado químico, conjugado ou desconjugado. A absorção da HRP mostrou-se mais intensa com os sais biliares sob a forma desconjugada, em especial o sal biliar secundário Deoxicólico, onde as lesões ultra-estruturais aos sistemas de membranas celulares foram mais graves, incluindo o aparelho de Golgi, retículo endoplásmico e mitocôndria (Figura 2). Tem sido descrito que a presença de sais biliares desconjugados na luz do intestino delgado superior também provoca alterações funcionais sobre o transporte de água e sódio, assim como acarreta má absorção de glicose. Nossos achados indicam que sais biliares desconjugados lesam a integridade da barreira anteposta pela junção firme dos enterócitos permitindo, assim, a penetração do marcador protéico potencialmente alergênico desde o lúmen para a circulação sistêmica. Na mucosa intestinal normal as junções firmes, que constituem uma fusão apical das membranas plasmáticas laterais das células epiteliais adjacentes, constituem uma verdadeira barreira à penetração de macromoléculas desde o lúmen intestinal à circulação e vice-versa. Atualmente há nítidas evidências de que esta barreira pode ser destruída durante certas condições fisiopatológicas, tais como: infecções entéricas provocadas por certos agentes enteropatogênicos tais como as cêpas entero-aderentes de Escherichia coli e as cêpas entero-agregativas de Escherichia coli, desnutrição protéico-calórica, trauma cirúrgico, ingestão crônica de álcool, condições de hiperosmolaridade etc.

B- Possíveis Implicações

Desnutrição e diarréia constituem um binômio praticamente inseparável contribuindo decisivamente como uma das principais causas de mortalidade infantil nos países em desenvolvimento.

Um aspecto peculiar da desnutrição protéico-calórica está representado pela alta freqüência de sobrecrescimento da microflora colônica nas porções superiores do intestino delgado. A ruptura dos mecanismos reguladores da flora bacteriana, tais como, hipocloridria gástrica, hipomotilidade e hipotonia intestinais, deficiências imunológicas, etc., associados a condições ambientais insalubres, altamente contaminados devido a ausência de água potável e saneamento básico, propiciam o sobrecrescimento bacteriano e acarretam sérias conseqüências para o hospedeiro.

Bactérias intestinais, em especial as anaeróbias, atuam sobre os sais biliares primários, desconjugando-os, acarretando diminuição da concentração micelar crítica, impedindo a formação da micela mista. Como decorrência direta deste efeito ocorre deficiente solubilização dos gorduras da dieta, com conseqüente esteatorréia. Estas bactérias também possuem a capacidade de atuar sobre os sais biliares primários porvocando 7 alfa desidroxilação (Figura 6), transformando-os em sais biliares secundários, o que irá desencadear graves alterações morfo-funcionais no intestino delgado.

Figura 6- Representação esquemática da ação das bactérias anaeróbias sobre os sais biliares primários causando 7 alfa desidroxilação e desconjugação, transformando-os em sais biliares secundários.

Além disso, a associação dos sais biliares secundários e desconjugados com as bactérias anaeróbias presentes na luz do intestino delgado é altamente lesiva para a mucosa jejunal acarretando graves deficiências digestivo-absortivas que irão trazer repercussões indesejáveis para a saúde do indivíduo afetado por esta síndrome.

Em conclusão, absorção aumentada de macromoléculas protéicas intactas, potencialmente antigênicas, como foi observado nas condições definidas por este experimento, deve alertar para a possibilidade do aparecimento de alergia alimentar devido à ruptura da barreira de permeabilidade intestinal, mesmo levando-se em conta todas as reconhecidas possiveis limitações advindas de um estudo experimental e suas respectivas dificuldades de transposição para aquela vivenciada na atividade clínica.

No nosso próximo encontro discutirei com riqueza de detalhes as principais implicações clínicas que estas alterações fisiopatológicas, aqui demonstradas, tem provocado nos seres humanos.