Reações de Fermentação: aquilo que vale a pena saber a respeito delas (Parte 2)

Ulysses Fagundes Neto

Diretor Médico do IGASTROPED

(www.igastroped.com.br)

Fermentação Alcoólica

O termo fermentação vem do latim “fervere”, que significa ferver.

Foi Pasteur, há pouco mais de um século, quem demonstrou que a fermentação alcoólica é realizada por micro-organismos na ausência de oxigênio. Atualmente, por fermentação alcoólica entende-se um conjunto de reações bioquímicas provocadas por micro-organismos chamados leveduras, que atacam fundamentalmente os carboidratos da uva (glicose e frutose), transformando-os principalmente em álcool etílico e gás carbônico. Na superfície da casca da uva, existe uma grande quantidade destes fungos. O bagaço da uva não é liso, sua epiderme é recoberta por uma matéria cerosa chamada previna, que retém os micro-organismos. Na previna, junto às leveduras úteis, encontram-se diversos outros micro-organismos, sendo alguns deles desfavoráveis do ponto de vista técnico, como é o caso da bactéria acética (Figura 10).

Figura 10- Fase inicial do processo de vinificação.

O processo de fermentação alcoólica caracteriza-se como uma via catabólica, na qual há degradação das moléculas do carboidrato (glicose ou frutose), no interior da célula dos micro-organismos (levedura ou bactéria) até a formação de etanol e CO₂, acarretando liberação de energia química e térmica.

O piruvato (proveniente da glicólise) sofre descarboxilação em uma reação irreversível catalisada pela enzima piruvato descarboxilase. É uma reação de descarboxilação simples e não envolve a oxidação do piruvato. A piruvato descarboxilase requer Mg₂+ e possui uma coenzima firmemente ligada, a tiamina pirofosfato (TPP), que é um cofator essencial para a piruvato-descarboxilase. Esse cofator irá proporcionar estabilidade à reação de troca de carga negativa.

Por meio da ação da álcool-desidrogenase, o acetaldeído é reduzido a etanol, com o NADH, derivado da atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, fornecendo o poder redutor. Portanto, os produtos finais da fermentação alcoólica são:

Glicose + 2ADP + 2 Pi = 2 etanol + 2 CO₂ + 2 ATP + 2 H₂O

É importante ressaltar que, como a quantidade de NADH é limitada e ele é necessário estar presente na sua forma oxidada (NAD+) na glicólise e, consequentemente, na continuação do processo de produção de energia, o NADH tem que ser oxidado. Essa é a importância da realização da fermentação.

O CO₂ produzido na descarboxilação do piruvato pelas leveduras é o responsável pela carbonatação caraterística do champanhe e da cerveja, assim como pelo crescimento da massa do pão e do bolo (Figura 11).

Figura 11– Fermentação alcoólica na produção do pão.

O processo de fabricação da cerveja, cujos subprodutos álcool etílico e CO₂ (gás carbônico) são obtidos a partir do consumo de açúcares presentes no malte, é realizado através da cevada germinada. Este é o mesmo processo usado no preparo da massa do pão e do bolo, onde as leveduras ou fungos consomem o carboidrato obtido do amido da massa do trigo, liberando CO₂ (gás carbônico), o que aumenta o volume da massa.

A enzima álcool-desidrogenase está presente em muitos organismos que metabolizam o álcool, incluindo o ser humano. No fígado humano esta enzima catalisa a oxidação do etanol, quer ele seja ingerido quer ele seja produzido por micro-organismos intestinais, com a concomitante redução do NAD+ para NADH.

As leveduras que se destacam como produtoras do etanol são as espécies do gênero Saccharomyces, Schizosaccharamyes, Pichia e outras (Figura 12).

Figura 12 - Saccharomyces cerevisiae

Os critérios tecnológicos que fazem com que uma levedura seja utilizada comercialmente na fermentação alcoólica são o alto rendimento e a elevada produtividade, ou seja, rápida conversão de açúcar em álcool, com baixa produção de componentes secundários. A espécie mais importante de levedura alcóolica é a Saccharomyces cerevisiae, que possui um largo espectro de utilização, sendo empregada na produção de pães, bebidas alcoólicas, etanol, etc. Sua biomassa pode ser recuperada como subproduto da fermentação e transformada em levedura seca, que se constitui em matéria-prima para a fabricação de ração animal ou suplemento vitamínico para o ser humano.

A bactéria Zymomonas mobilis, que inicialmente foi isolada em mostos fermentadores de cidra, sucos fermentados de palmeiras, em cervejarias e engenhos de aguardente, apresentou habilidades promissoras de transformar açúcares em etanol e gás carbônico, em condições comparáveis a aquelas exibidas pelas leveduras. Zymomonas mobilis apresenta alto rendimento, tolerância a altas concentrações de glicose, habilidade de crescer em total anaerobiose, características que potencializam seu emprego em escala industrial.

Mecanismo da fermentação alcoólica

Atualmente a indústria enológica vai se direcionando cada vez mais para a utilização de fermento selecionado (leveduras selecionadas), no processo de vinificação (Figura 13).

Figura 13

A fermentação alcóolica ocorre devido ao fato de que as células do levedo produzem a energia que lhes é necessária para sobreviver, através de dois fenômenos de degradação da matéria orgânica: 1- a respiração que necessita do O₂ do meio ambiente, ou 2- a fermentação que ocorre na ausência de O₂.

Como anteriormente assinalado, em virtude de a fermentação alcóolica corresponder a uma baixa produção de energia, a levedura necessita transformar muito açúcar em álcool, para poder assegurar suas necessidades energéticas. Nessas condições a capacidade de multiplicação da levedura é baixa. Por outro lado, o rendimento da transformação do açúcar em álcool é grande em relação ao peso da levedura. A composição exata do açúcar foi determinada por Gay-Lussac. É ainda de sua autoria a equação que descreve a fermentação alcóolica:

C6H12O6 (glicose) = 2 C2H5OH (álcool etílico) + 2 CO₂  

Ou seja, para cada 180g de glicose, resultam 92g de álcool etílico e 88g de CO₂. Esta reação, apesar de representar a parte fundamental do processo não é, porém, completa, pois outras substâncias se formam além do álcool etílico e CO₂.

A proporção de álcool contida no vinho é medida em graus alcoólicos, segundo o princípio de Gay-Lussac. Assim, por exemplo, quando se diz que um vinho tem 11ºGL significa que contém 11% do seu volume em álcool, ou seja, que em 100 ml do vinho considerado, 11 ml são álcool puro (anidro) (Figura 14).

 Figura 14- Representação esquemática das fases da produção do vinho.

Produção de etanol

Depois da água, o álcool é o solvente mais comum, além de representar a matéria-prima de maior uso no laboratório e na indústria química.  Na biossíntese do etanol são empregadas linhagens selecionadas de Saccharomyces cerevisae, que realizam a fermentação alcoólica, a partir de um carboidrato fermentável. É muito importante que a cultura da levedura possua um crescimento vigoroso e uma elevada tolerância ao etanol, pois desta forma a fermentação irá apresentar um grande rendimento final. 

O etanol, em altas concentrações, é inibidor e a tolerância das leveduras é um ponto crítico para uma produção elevada deste metabólito primário. A tolerância ao etanol varia consideravelmente de acordo com as linhagens de leveduras. De modo geral, o crescimento cessa quando a produção atinge 5% de etanol (v/v), e a taxa de produção é reduzida a zero, na concentração de 6 a 10% de etanol (v/v).   

O etanol pode ser produzido a partir de qualquer carboidrato fermentável pela levedura, a saber: sacarose, sucos de frutas, milho, melaço, beterrabas, batatas, malte, cevada, aveia, centeio, arroz, sorgo, entre outros (necessário hidrolisar os carboidratos complexos em açúcares simples fermentáveis, pelo uso de enzimas da cevada ou fúngicas, ou ainda pelo tratamento térmico do material acidificado).

Material celulósico, como madeira e resíduos da fabricação da pasta de papel podem ser utilizados. Por causa da grande quantidade de resíduos de material celulósico disponível, a fermentação direta desses materiais quando hidrolisados por enzimas celulolíticas pode ser de grande importância econômica.

Culturas mistas de Clostridium thermocellum e Clostridium thermosaccharolyticum podem ser usadas. Hemiceluloses e celuloses são hidrolisadas em monossacarídeos (hexoses e pentoses) por essas bactérias e os monossacarídeos são fermentados diretamente a etanol.

O etanol é também usado como combustível, e, no Brasil, a maior parte da produção de etanol é destinada para a indústria de combustíveis. Essa preferência é pelo fato de o etanol não produzir dióxido de enxofre quando é queimado, ao contrário da gasolina que polui a atmosfera.  

A produção de etanol feita a partir da cana-de-açúcar obedece aos seguintes procedimentos:  

1.   Moagem da cana: A cana passa por um processador, nessa etapa obtém-se o caldo de cana, também conhecido como garapa que contém um alto teor de sacarose, cuja fórmula é: C12H22O11.  

2.   Produção de melaço: O produto obtido no primeiro passo, a garapa, é aquecido para se obter o melaço, que consiste numa solução de aproximadamente 40% em massa, de sacarose. O açúcar mascavo é produzido quando parte dessa sacarose se cristaliza.  

3.   Fermentação do melaço: Neste momento, fermentos biológicos são acrescentados ao melaço, como por exemplo, o Saccharomyces, que é um tipo de levedura que faz com que a sacarose se transforme em etanol. A ação de enzimas é que realiza esse trabalho. Após esse processo, se obtém o mosto fermentado, que já contém até 12% de seu volume total em etanol.  

4.   Destilação do mosto fermentado: Nesta fase o produto, que no caso é o mosto, vai passar pelo processo de destilação fracionada e vai dar origem a uma solução cuja composição será: 96% de etanol e 4% de água. Existe uma denominação que é dada em graus, é o chamado teor alcoólico de uma bebida. No caso do etanol é de 96° GL (Gay-Lussac).

A cachaça é produzida da mesma forma que o álcool, com a única diferença, pois a coluna de destilação fracionada usada não precisa ser tão eficiente, podendo deixar passar mais água (em geral 60%, pois a cachaça tem teor alcoólico aproximadamente de 40º GL). A cachaça é considerada uma bebida alcoólica destilada (Figura 15).

Figura 15 –Processo de produção da cachaça.

Figura 16– Foto panorâmica de uma destilaria de cachaça.

Figura 17– Foto da cachaça recém produzida jorrando da bica de destilação.

Por outro lado, o vinho é uma bebida alcoólica não-destilada. O suco de uva sofre fermentação, após o que o líquido é filtrado e colocado em barris e garrafas. Pelo fato de não sofrer destilação, o sabor e o aroma de um vinho dependem muito do tipo de uva utilizado, pois as substâncias responsáveis pelo aroma e sabor da uva estarão presentes também no vinho, uma vez que não são separadas por destilação.

As bebidas não-destiladas apresentam teor alcoólico inferior ao das destiladas. Isso ocorre porque, quando o teor alcoólico chega a cerca de 15ºGL, os micro-organismos morrem e a fermentação se encerra. Na destilação, como o álcool é mais volátil que a água, o teor alcoólico aumenta.

Fermentação Malo-láctica

Muitos vinhos sofrem uma fermentação secundária, após a primeira que é a alcoólica.

Essa fermentação é provocada por bactérias lácticas, como por exemplo: Leuconostoc oinos, que transformam o ácido málico (dicarboxílico) em ácido láctico (monocarboxílico), de sabor mais aveludado, e em CO₂. Em várias regiões do mundo, por motivos de origem climática, frequentemente são obtidos vinhos tintos com elevada acidez, que irão desta forma se beneficiar com essa segunda fermentação, posto que esta provoca uma redução na acidez (desacidificação biológica). Essa fermentação é normalmente desejável nos vinhos tintos, porém, nem sempre o é para os vinhos brancos.

Reações de Fermentação: aquilo que vale a pena saber a respeito delas (Parte 1)

Ulysses Fagundes Neto

Diretor Médico do IGASTROPED

Introdução

A fermentação é um processo de obtenção de energia que ocorre sem a presença de oxigênio (O₂), portanto, trata-se de uma via de produção de energia denominada anaeróbia. A fermentação compreende um conjunto de reações enzimaticamente controladas, através das quais uma molécula orgânica é degradada em compostos mais simples, liberando energia. Nesse processo, o aceptor final de elétrons é uma molécula orgânica. Essa via é muito utilizada por fungos, bactérias e células musculares esqueléticas do corpo humano, quando estas últimas estão em contração vigorosa e prolongada. A glicose é uma das substâncias mais empregadas pelos micro-organismos como ponto de partida da fermentação. É importante ressaltar que as reações químicas da fermentação são equivalentes às da glicólise, as quais ocorrem no fígado do organismo humano. A desmontagem da glicose é parcial e são produzidos resíduos de tamanho molecular maior que aqueles gerados na respiração aeróbia e o rendimento final da fermentação em produção de Adenosina Trifosfato (ATP) é baixo.

Na glicólise, cada molécula de glicose é desdobrada em 2 moléculas de ácido pirúvico, com liberação de hidrogênio e energia, por meio de várias reações químicas.

O hidrogênio combina-se com moléculas transportadoras de hidrogênio (NAD), formando NADH + H⁺, ou seja, NADH₂ (Figura 1).

Figura 1- Processo da glicólise

No caso das células musculares estriadas, a fermentação ocorre no citosol e inicia-se com a glicólise, isto é, a quebra de glicose em duas moléculas de piruvato. Percebe-se, portanto, que inicialmente esse processo é semelhante à respiração celular. O piruvato recebe elétrons H⁺ provenientes da enzima aceptora de hidrogênio (NADH) e transforma-se em ácido láctico, que posteriormente é eliminado pela célula. Quando o ácido pirúvico é transformado em ácido láctico, dizemos que ocorreu uma fermentação láctica. A fermentação láctica é comum em células musculares quando submetidas a um esforço intenso e prolongado.

O piruvato pode também se transformar em álcool e CO_2, que também são posteriormente eliminados. A substância a ser produzida depende do organismo em que o processo ocorre, mas quando se transforma em álcool, a fermentação é chamada de alcoólica.

Tanto na fermentação alcoólica quanto na láctica o NADH doa seus elétrons e é convertido em NAD⁺ (Figura 2).

Figura 2- Esquema que ilustra o processo das fermentações láctica e alcoólica a partir da glicose.

Diferentemente do ser humano, na indústria alimentícia a fermentação láctica é realizada pela utilização de bactérias, protozoários e fungos, para a produção de iogurte, coalhada e queijos. No caso da fermentação alcoólica, esta é usualmente realizada por leveduras e bactérias, sendo bastante explorada economicamente pela indústria, principalmente para a fabricação de alimentos como o pão, bolos e bebidas, tais como a cerveja, o vinho e os destilados.

É importante enfatizar que o rendimento da fermentação é bastante pequeno quando comparado ao da respiração aeróbica (Figura 3). 

Figura 3- Representação esquemática da respiração aeróbica.

Enquanto que no processo de fermentação são obtidas apenas 2 moléculas de ATP, na respiração aeróbica, há um saldo final muito maior, de 38 ATP (Figura 4).

Figura 4- Quadro comparativo entre a produção de energia na reação de fermentação e na respiração aeróbica.

Curiosidade: Quando o ser humano está praticando exercícios físicos extenuantes, frequentemente pode sentir dor muscular, que também é chamada de fadiga muscular. Isso ocorre porque as células musculares não recebem a quantidade necessária de oxigênio para realizar a respiração aeróbica e, então, passam a quebrar glicose de forma anaeróbia, produzindo ácido láctico. O acúmulo desse ácido faz com que as pessoas sintam dor muscular (Figura 5).

Figura 5- Representação esquemática da reação de fermentação láctica no músculo estriado submetido a grande esforço e exaustão.

A fermentação láctica nas células musculares é um processo que ocorre de forma alternativa, frente a situações em que o organismo não realiza respiração aeróbica. Este processo é considerado um artifício metabólico de curto prazo, que é ativado quando o organismo é submetido a um intenso esforço físico em condições de baixa oxigenação muscular. 

De acordo com Pasteur, tanto a velocidade da fermentação quanto a quantidade total de glicose por ela consumida eram muitas vezes maiores em condições anaeróbicas do que sob condições aeróbicas. O chamado efeito Pasteur ocorre porque o rendimento em ATP da glicólise, sob condições anaeróbicas (2 ATP por molécula de glicose) é muito menor do que a obtida na oxidação completa da glicose até o CO₂ e H₂O, sob condições aeróbicas (36 a 38 ATP por molécula de glicose). Portanto, para produzir a mesma quantidade de ATP, é necessário consumir perto de 18 vezes mais glicose em condições anaeróbicas do que em condições aeróbicas.

Vale ressaltar que a desvantagem anaeróbia em relação à aeróbia, consiste não somente na quantidade de ATP, mas aos efeitos fisiológicos causados. Em decorrência a extensos períodos de atividade fermentativa (exercícios físicos prolongados), as células musculares passam a acumular uma concentração muito elevada de ácido láctico, prejudicando o funcionamento da célula. 

Entre os efeitos provocados em defesa do metabolismo, o organismo passa a sentir dor e fadiga muscular, causada por uma contração arrítmica (gradativa ou repentina) atuando como sinal de alerta, induzindo o fim da atividade para o repouso e o restabelecimento da capacidade fisiológica do órgão (Figura 6).

Figura 6- Produção de lactato no músculo.

Isso ocorre à medida em que o excesso de ácido láctico se difunde para o fígado, onde é convertido em ácido pirúvico e posteriormente em glicose armazenada na forma de glicogênio, sendo a conversão denominada de gliconeogênese (Figura 7).

Figura 7- Esquema da gliconeogênese.

Por outro lado, no que diz respeito à fermentação alcoólica os seres humanos têm se beneficiado deste processo há milhares de anos por meio da utilização de leveduras para produzir pão, cerveja e vinho, mas somente passaram a ter conhecimento da intimidade desta reação a partir dos últimos duzentos anos.

A fermentação alcoólica, também conhecida como fermentação do etanol, é a via anaeróbia realizada por leveduras, na qual açúcares simples são convertidos em etanol e dióxido de carbono (Figura 8).

Figura 8- Representação da equação de produção do etanol.

Em alguns casos a fermentação é usada para modificar um material cuja transformação seria difícil ou muito cara, caso fossem escolhidos métodos químicos convencionais. A fermentação é sempre iniciada por enzimas que atuam como catalisadores naturais que provocam uma mudança química sem serem afetados por isto.

Os produtos da fermentação têm sido usados desde a antiguidade. Habitantes das cavernas descobriram que a carne envelhecida tem um sabor mais agradável que a carne fresca. Vinho, cerveja, e pão são tão velhos quanto a agricultura, e inclusive, foram encontrados pães nas pirâmides egípcias construídas há milhares de anos (Figura 9).

Figura 9- Produção do pão.

O queijo, que envolve a fermentação do leite, é outro alimento muito antigo e sua fabricação na China e no Japão era conhecida há milhares de anos. O valor medicinal de produtos fermentados é conhecido desde longa data. Os chineses usavam coalho de feijão-soja mofado para curar infecções de pele há 3.000 anos. Os nativos da América Central tratavam feridas infectadas com fungos.

O conhecimento íntimo da química das fermentações é uma ciência nova que ainda está em suas fases mais iniciais. É a base dos processos industriais que convertem matérias-primas como grãos, açúcares e subprodutos industriais em muitos produtos sintéticos diferentes. Cepas cuidadosamente selecionadas de mofos, leveduras e bactérias são usadas para estas transformações.

As primeiras plantas industriais a utilizar a tecnologia da fermentação foram as fábricas de cerveja. No entanto, foi somente no final do século XIX e início do século XX que essa tecnologia passou a ser gradativamente utilizada, tanto na indústria de bebidas e de alimentos, como na indústria química. A indústria química, nos primórdios do século XX, principiou a produção de solventes orgânicos. No início da I Guerra Mundial as necessidades de produzir acetona, composto orgânico importante para a produção de explosivos, estimularam substancialmente a pesquisa no potencial da tecnologia de fermentação.

Em 1923, Pfizer inaugurou a primeira fábrica para a produção de ácido cítrico por via fermentativa. O processo envolvia a fermentação utilizando o fungo Aspergillus niger, por meio do qual o açúcar era transformado em ácido cítrico.

Foi em uma descoberta casual que um funcionário de um mercado encontrou um melão embolorado por uma linhagem de Penicillium, a qual podia prosperar quando cultivada em tanques fundos com aeração, e que produzia duzentas vezes mais penicilina que o bolor de Fleming cultivado em meio sólido.

O progresso da fermentação prossegue a passadas largas. A cada ano novos produtos são incorporados à lista de produtos derivados da fermentação. Várias vitaminas são produzidas pelo emprego de etapas de fermentação em sua síntese (vitamina B-2 a riboflavina, vitamina B-12 a cianocobalamina e a vitamina C o ácido ascórbico).

Alguns dos bioprocessos mais interessantes são as desidrogenações e hidroxilações específicas do núcleo esteróide. Essas transformações são vias econômicas utilizadas na obtenção da cortisona, um potente agente anti-inflamatório e seus derivados.

O ácido cítrico é uma das muitas substâncias químicas produzidas por micro-organismos. É usado em limpadores de metal, bem como trata-se de um preservativo de alimentos, além de ser também um agente capaz de conferir melhor palatabilidade aos alimentos. O ácido cítrico é responsável pelo sabor azedo das frutas cítricas. Poderia ser obtido delas, mas necessitaria muitos milhares de frutos para produzir a mesma quantidade de ácido cítrico obtida pela fermentação do melado com o mofo do Aspergillus niger.

Na Tabela 1 estão listados os tipos de fermentação conhecidos.

Tabela 1- Tipos de Fermentação