Enfermedad Celíaca: Marcadores serológicos y genéticos (Parte 2)

Ulysses Fagundes Neto (Brasil), María del Carmen Toca (Argentina), Luis Ortigoza (España), Daniela Armas (Uruguay), Aldo Maruy (Peru), Mabel Mora (Argentina), Víctor Peña (Bolivia)

Aquellos criterios diagnósticos fueron aceptados unánimemente por la comunidad científica internacional, y sirvieron de guía protocolizada para el correcto diagnóstico de niños bajo sospecha de ser celíacos, y precisaban la realización de al menos tres biopsias intestinales secuenciales hasta completar el diagnóstico final de EC.

Esta estricta metodología diagnóstica, basada en la práctica de repetidas biopsias de intestino delgado fue mantenida hasta que la propia Sociedad Europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica (ESPGHAN) la modificó veinte años más tarde, gracias al advenimiento de los marcadores serológicos, proponiendo una reducción en el número de biopsias. El diagnóstico se confirmaba con la demostración de lesión de la mucosa intestinal, mientras el paciente consumía dieta con gluten, con una primera biopsia, y requiriendo sólo una segunda biopsia en casos muy concretos: pacientes asintomáticos al diagnóstico, o con primera biopsia no definitoria, o en los que la primera biopsia se había realizado antes de los 2 años de edad.

Pero a lo largo de los últimos años, se han venido produciendo decisivos avances en el conocimiento de los aspectos clínicos, inmunológicos y genéticos de la EC, conociéndose cada vez mejor las distintas formas clínicas de expresión de la misma (el llamado “iceberg celíaco”), y sus manifestaciones digestivas y extradigestivas, con formas activas, silentes, latentes y potenciales. La parte oculta de este “iceberg celíaco” es cada vez más evidente, y en los últimos 20 años conocemos mejor este importante aspecto de la EC (Figuras 15-16-17-18):

Figura 15- Anticorpos anti-gliadina.

Figura 16- Anticorpo anti-endomíseo.

Figura 17- Anticorpo anti-transglutaminase.

Figura 18- Anticorpo anti-gliadina deaminada.

-      El amplio espectro clínico de presentación, sabiéndose en la actualidad que la EC es una enfermedad multisistémica, y no localizada exclusivamente en el intestino delgado

-      Las enfermedades asociadas y los distintos grupos de riesgo relacionados con la EC

La etiopatogenia e inmunogenética de la EC: evidencia de genes de susceptibilidad HLA DQ2/DQ8 relacionados con la EC, descubrimiento de la transglutaminasa tisular como el autoantígeno de la EC y desarrollo de marcadores serológicos de actividad altamente sensibles y específicos para el diagnóstico de la EC (anticuerpos antigliadina como primeros marcadores, y posteriormente, anticuerpos antiendomisio, anticuerpos antitransglutaminasa y anticuerpos antigliadina deaminados).

Paralelamente al avance en la investigación en estos aspectos clínicos y de laboratorio de la EC, también se ha demostrado el cambiante espectro histológico de las lesiones intestinales de los pacientes celíacos en actividad, habiéndose demostrado que no es necesaria la existencia de una lesión severa de las vellosidades intestinales para el diagnóstico, y hoy en día sabemos que la EC en actividad puede presentar lesiones de bajo grado (Figura 19).

Figura 19- Progressão sequencial da lesão da mucosa duodenal na Doença Celíaca.

Marcadores serológicos

Los marcadores serológicos son herramientas muy útiles, tanto para el diagnóstico como para el seguimiento de la EC.

La determinación de anticuerpos antigliadina (AGA) de clases IgA e IgG fue la primera prueba serológica que se utilizó en el diagnóstico de la EC a comienzos de los años 70 del siglo pasado. Sin embargo, los AGA aunque tienen buena sensibilidad, se detectan con frecuencia en personas sanas o en otros trastornos digestivos no celíacos, por lo que su uso está actualmente desautorizado por la Federación de Sociedades de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica (FISPGHAN), y en estudios posteriores se ha demostrado que la utilización de estos anticuerpos en niños mayores de 2 años no es útil (Figuras 20-21-22).

Figura 20- Sensibilidade e especificidade do anticorpo anti-gliadina.

Los anticuerpos antiendomisio (EMA) comenzaron a utilizarse en los años 80, y tienen una sensibilidad y especificidad muy altas en el diagnóstico de la EC. Se determinan por inmunofluorescencia indirecta (IFI) con una técnica cualitativa o semicuantitativa, con diluciones progresivas del suero, y lectura en microscopio de fluorescencia, que requiere alta cualificación de personal.

Figura 21- Sensibilidade e especificidade do anticorpo anti-endomíseo.

Los anticuerpos antitransglutaminasa tisular (ATGt) se determinan utilizando técnicas automatizadas de inmunoanálisis cuantitativo (ELISA), con una especificidad y sensibilidad del 95%.

Figura 22- Sensibilidad e especificidade do anticorpo anti-transglutaminase.

Los anticuerpos antigliadina deaminados (AGAdp) son los últimos marcadores introducidos en el diagnóstico de la EC, utilizando como antígeno los péptidos de gliadina modificados, y surgen a raíz de la investigación para mejorar la eficiencia de los AGA nativos.    

En la actualidad, la oferta de testes comerciales para la determinación de estos marcadores serológicos de actividad de EC es muy amplia, tanto por el anticuerpo analizado (AGA, EMA, ATGt, AGAdp, mixtos ATGt/AGAdp) como por el isotipo de cada anticuerpo (IgA, IgG, polivalente IgA/IgG), como por la tecnología utilizada (IFI, ELISA, fluoroenzimoinmunoensayo, quimioluminiscencia), por lo que la elección del test debe basarse en las recomendaciones internacionales y en los datos basados en la evidencia científica. Cada laboratorio debe utilizar el test más eficaz en función del contexto asistencial en el que se encuentre.

Los anticuerpos ATGt y/o anticuerpos EMA de clase IgA (o de clase IgG si existe déficit de IgA) son en la actualidad los marcadores de elección para el diagnóstico de EC, según las últimas recomendaciones de la ESPGHAN. Los anticuerpos AGAdp de clase IgG son de gran utilidad en niños menores de 2 años, en niños con déficit de IgA, o cuando los ATGt son negativos.

Es importante resaltar que el laboratorio debe ofrecer garantías de:

-    Participación en programas de control de calidad interno y externo.

-    Utilizar testes validados, y con valores de corte (“cut-off”) bien establecidos por el fabricante para cada grupo de edad.

-    Expresar los resultados con cifras numéricas, indicando la clase de inmunoglobuilina (IgA o IgG), no siendo suficiente con la información de “positivo” o “negativo”.

-    Los informes de EMA deben indicar también la clase de Ig y la dilución sérica final, presentando el resultado como negativo o positivo acompañado de la dilución

Aunque se han desarrollado testes rápidos para el diagnóstico de EC, mediante técnicas de inmunocromatografía, conocidos como test de punto de contacto (POC), con determinación de anticuerpos ATGt y anticuerpos AGA en una gota de sangre, y que podrían ser utilizados en programas de cribado o en una primera aproximación diagnóstica a la EC en pacientes sintomáticos, en el momento actual este tipo de test sólo debe utilizarse con fines de investigación, y no pueden sustituir a las técnicas utilizadas en el laboratorio.

Marcadores genéticos

La EC está fuertemente ligada con los genes HLA DQ2 y HLA DQ8, de forma que más del 90% de los pacientes celíacos muestran una variante del heterodímero HLA DQ2, y el resto suelen presentar un segundo heterodímero de riesgo, HLA DQ8. La presencia de estos marcadores genéticos de susceptibilidad en la población general no implica necesariamente que ese individuo vaya a desarrollar la EC. Varios estudios demostraron que cerca del 30% a 40% de la población tiene estos heterodimeros y no presenta EC. Su determinación tiene un valor predictivo negativo cercano al 100%, de modo que su ausencia permite descartar casi con total seguridad el desarrollo de la enfermedad (Figuras 23-24-25).

Figura 23- Complexo genético HLA DQ2/DQ8.

Figura 24- Complexo genético HLA DQ2/DQ8.

Figura 25- Complexo genético HLA DQ2/DQ8.

Hay que tener en cuenta que, en determinadas poblaciones latinoamericanas, con diagnóstico de EC, no se han encontrado haplotipos HLA DQ2 ni DQ8, como sucede en una serie de pacientes celíacos de Chile, Argentina y Uruguay estudiados por Araya y cols, que eran DQ2/DQ8 negativos.

CONCLUSIONES

La confirmación diagnóstica de la Enfermedad Celíaca (EC) requiere una combinación de distintas variables: manifestaciones clínicas, anticuerpos específicos, haplotipo HLA DQ2 y/o DQ8 y enteropatía. De acuerdo a las últimas evidencias, el patrón oro para el diagnóstico de la EC no está exclusivamente determinado por los resultados de la biopsia intestinal.

Los marcadores serológicos constituyen la primera herramienta en el algoritmo diagnóstico. Los anticuerpos ATGt, EMA, y AGAdp IgG en niños menores de 2 años o niños con déficit de IgA, son los de mayor sensibilidad y especificidad.

Para que los marcadores serológicos tengan peso suficiente en el diagnóstico y sean efectivamente útiles deben cumplir con los siguientes requisitos:

u  Realizarse en laboratorios con control de calidad interno y externo.

u  Los testes deben ser validados con valores de cortes bien establecidos.

u  ATGt y AGAdp: indicar de qué clase son (IgA/IgG) y expresados en cifras.

u  EMA: indicar de qué clase son (IgA/IgG) y expresar dilución.

La tipificación del HLA para el diagnóstico de EC tiene un alto valor predictivo negativo, cercano al 100%. Su ausencia hace muy poco probable la ocurrencia de EC.

Los individuos asintomáticos pertenecientes a grupos de riesgo siempre deben diagnosticarse con biopsia duodenal confirmatoria.

Enfermedad Celíaca: Marcadores serológicos y genéticos (Parte 1)

Ulysses Fagundes Neto (Brasil), María del Carmen Toca (Argentina), Luis Ortigoza (España), Daniela Armas (Uruguay), Aldo Maruy (Peru), Mabel Mora (Argentina), Víctor Peña (Bolivia)

Hasta hace algunas décadas, la Enfermedad Celíaca (EC) o Celiaquía, era considerada una enfermedad poco frecuente, que afectaba fundamentalmente a niños, y que se manifestaba con síntomas exclusivamente digestivos, con un cuadro de malabsorción intestinal y desnutrición (Figuras 1-2-3-4).

Figura 1- Gráfico pondero-estatural da paciente abaixo evidenciando uma perda de peso significativa e parada do ritmo de crescimento.

Figura 2- Paciente representada no gráfico de crescimento acima, portadora de Doença Celíaca na sua forma clássica com distensão abdominal e edema tibial.

Figura 3- Paciente portadora de Doença Celíaca na forma clássica evidenciando atrofia da musculatura glútea e emagrecimento intenso com perda da massa celular subcutânea.

Figura 4- Paciente portador de Doença Celíaca na forma clássica apresentando emagrecimento intenso com ausência da massa celular subcutânea, atrofia da musculatura glútea e edema pré-tibial e após alguns meses de adesão à dieta isenta de glúten, mostrando nítida recuperação clínica e nutricional.

Actualmente está bien establecido que la EC es un trastorno muy frecuente, con una incidencia aproximada de 1:100 en la población caucásica, de distribución mundial, que afecta tanto a niños como adultos y que puede manifestarse como una enfermedad multisistémica, con distintas formas clínicas de expresión (Figuras 5-6-7).

Figura 5- Prevalência da Doença Celíaca no mundo ocidental.

Figura 6- Prevalência da Doença Celíaca em alguns países da Europa e dos Estados Unidos.

Figura 7- Prevalência da Doença Celíaca em diferentes cidades do Brasil.

Aunque el cuadro clásico de malabsorción, con diarrea, pérdida de peso y atrofia de las vellosidades de la mucosa intestinal sigue siendo prevalente, a lo largo de los últimos años se está asistiendo a un aumento de las presentaciones subclínicas y atípicas, con manifestaciones extraintestinales, especialmente en niños mayores y en los adultos (Figuras 8-9-10).

Figura 8- Manifestação extra-digestiva da Doença Celíaca com defeito do esmalte dentário.

Figura 9- Manifestação extra-digestiva da Doença Celíaca com calcificações occipitais e epilepsia.

Figura 10- Manifestação extra-digestiva da Doença Celíaca com lesões dermatológicas - Dermatite Herpetiforme.

Los criterios diagnósticos de la EC en la infancia y adolescencia han ido modificándose de forma muy significativa a lo largo de los últimos 40 años, desde que, en el año 1969, fueran publicadas las primeras recomendaciones (por la entonces Sociedad Europea de Gastroenterología y Nutrición Pediátrica, ESPGAN), y que se basaban en datos clínicos y biopsias de la mucosa intestinal, que debían mostrar lesiones histológicas severas en los momentos de actividad, con normalización en las fases de dieta sin gluten (Figuras 11-12-13-14).

Figura 11- Lesão morfológica característica da Doença Celíaca evidenciando atrofia sub-total das vilosidades da mucosa duodenal.  

 Figura 12- O primeiro caso de Doença Celíaca totalmente documentado em nosso meio.

Figura 13- Paciente das Figuras 1 e 2 após a introdução da dieta isenta de glúten evidenciando completa recuperação clínica, nutricional e da sua curva de crescimento pondero-estatural.

Figura 14- Morfologia da mucosa duodenal normal após alguns meses da introdução da dieta isenta de glúten evidenciando a unidade funcional vilosidade/cripta na proporção de 4:1.

Sistema imune do intestino delgado: conceitos atuais (Parte 2)

Natália Oliveira e Silva e Ulysses Fagundes Neto

Enterócitos

Os enterócitos desempenham importante papel no processamento final dos nutrientes e na sua absorção. Eles possuem junções celulares especializadas (complexo juncional), que influenciam na permeabilidade da barreira intestinal. Além disso, os enterócitos tem participação nos mecanismos imunológicos, posto que sintetizam citocinas e quimiocinas, as quais atuam na transdução de sinais inflamatórios e, também, podem agir como células apresentadoras de antígenos (Figuras 5- 6).

Figura 5- Ultramicrofotografia em grande aumento de 2 enterócitos adjacentes evidenciando a junção firme (seta) poro extremamente seletivo dando passagem apenas a água e eletrólitos.

Figura 6- Ultramicrofotografia em grande aumento evidenciando 2 enterócitos adjacentes submetidos a diferentes situações experimentais: 1a- mostra a ruptura da barreira de permeabilidade caracterizada pela mancha enegrecida ao longo de todo o espaço intercelular; 1b- evidencia a preservação da junção firme em situação experimental fisiológica.

Células M

Estas são células epiteliais membranosas, especializadas na captura de antígenos para serem oferecidas aos tecidos linfóides da mucosa intestinal.

Células caliciformes

Estas células são especializadas na secreção do muco que recobre a superfície das vilosidades, e tem por função dificultar a penetração de agentes patogênicos. Além disso, protegem as células epiteliais das enzimas digestivas e lubrificam sua superfície (Figura 7).

Figura 7- Ultramicrofotografia em grande aumento mostrando uma célula caliciforme repleta de muco em seu interior.

Células de Paneth

Estas células estão presentes na base das criptas do intestino delgado, e, em maior concentração no íleo terminal. Elas são responsáveis pela maior produção de proteínas antimicrobianas do intestino delgado, tais como, as lisozimas, a-defensinas, fosfolipase A2 e lecitina. Tem sido demonstrado que estas células tem um mecanismo autônomo para detecção de bactérias com potencial invasivo, além de fungos, protozoários e vírus.

Macrófagos

Eles são responsáveis pela rápida eliminação de microrganismos que penetram na barreira mucosa, posto que atuam na fagocitose e destruição destes patógenos que penetram na lâmina própria.

Enzimas digestivas

Incluem enzimas gástricas, pancreáticas e da borda em escova. Estas enzimas apresentam papel de destaque na proteólise, que é um mecanismo eficaz para diminuir a possibilidade de absorção de proteínas capazes de desencadear reações alérgicas.

Imunidade adaptativa

Este sistema envolve os linfócitos, os quais proporcionam proteção duradoura após exposição ao antígeno, e, se dividem 2 grupos, a saber:

-          Humoral: mediada por linfócitos B e anticorpos produzidos por eles;

-          Celular: mediada por linfócitos T e citocinas.

Imunidade humoral

A resposta humoral do intestino é caracterizada pela produção de IgA no epitélio e sua secreção no lúmen intestinal. Trata-se da imunoglobulina mais abundante da mucosa (80-90%), ela é sintetizada na lâmina própria em resposta à ativação dos linfócitos T das placas de Peyer. Estruturalmente, existem 2 isoformas de IgA, a monomérica e a polimérica. A IgA polimérica secretada é resistente à proteólise intraluminal e tem importante papel no desenvolvimento da tolerância, no lúmen intestinal. A IgA pode formar imunecomplexos com os antígenos alimentares ou com patógenos, neutralizando-os e evitando sua penetração. Além disso, inibe a proliferação viral dentro do enterócito e neutraliza as enterotoxinas.

A IgA pode também atuar a nível intraepitelial e subepitelial, captando os antígenos que atravessam a barreira intestinal. A criança apresentará o mesmo número de células produtoras de IgA do adulto quando atingir 1-2 anos, período que a microbiota se torna semelhante à do adulto.

Imunidade cellular

A imunidade celular é mediada pelos linfócitos T e seus subprodutos. Os linfócitos T CD4+ são classificados em 2 subtipos, e são relacionados da seguinte forma com a inflamação da mucosa intestinal, a saber:

-          Tipo Th1, caracteriza-se por inflamação transmural e granulomatosa, como no caso da Doença de Crohn;

-          Tipo Th2 é caracterizada por inflamações superficiais com exsudato celular inflamatório agudo e edema da mucosa, como ocorre na colite ulcerativa.

Para evitar responder aos antígenos da dieta e à microbiota, o sistema imune do intestino exerce uma ação de supressão, que envolve tanto a tolerância oral, quanto o equilíbrio entre a resposta Th1/Th2, que são importantes fatores para evitar uma resposta imune inapropriada. Um dos mecanismos existentes para promover o equilíbrio entre tolerância e imunidade envolve a presença das células T reguladoras (Treg), que podem suprimir ativamente respostas antígeno-específicas. As células Treg são importantes no controle da resposta imune a antígenos do próprio indivíduo, evitando a autoimunidade e para manter a tolerância.

Linfócitos intraepiteliais

A resposta celular envolve os linfócitos intraepiteliais (LIE) que atuam na manutenção da integridade do epitélio intestinal. Estes localizam-se nos espaços intraepiteliais do intestino, onde são expostos a uma variedade de antígenos microbianos e alimentares. Um subtipo dos LIE, os linfócitos gama-delta, parecem desempenhar importante papel na tolerância oral. Os LIE gama-delta também contribuem com a imunidade adaptativa, restaurando a homeostase da mucosa após um dano ao epitélio, pois promovem o reparo do epitélio através da secreção de fatores de crescimento epitelial. Expressam fatores próinflamatórios e antimicrobianos em resposta a sinais da microbiota, e, consequentemente, atuam na limitação da penetração bacteriana na mucosa lesionada (Figura 8).

Figura 8- Esquema representativo do sistema imune intestinal.

Barreira de Permeabilidade Intestinal e suas possíveis alterações

O intestino constitui a maior interface entre o ser humano e o meio ambiente, e a existência de uma barreira intestinal intacta é, portanto, essencial na manutenção da saúde e na prevenção de doenças. A barreira intestinal possui vários componentes imunológicos e não imunológicos, sendo que a barreira epitelial é um dos componentes não-imunológicos mais importantes. A hiperpermeabilidade desta barreira pode contribuir para a patogênese de várias doenças gastrointestinais incluindo a alergia alimentar, doença inflamatória intestinal e doença celíaca.

Alergia alimentar

Algumas situações podem alterar os mecanismos protetores da barreira de permeabilidade intestinal e colocar em risco a tolerância oral e aumentar a suscetibilidade para o desenvolvimento de alergias alimentares. Dentre estas possíveis situações deve-se considerar o aumento da permeabilidade da barreira intestinal e a baixa atividade enzimática, que são observadas em recém-nascidos, lactentes e desnutridos. Outro fator deve-se à diminuição da secreção ácida gástrica por uso de medicamentos, posto que estes podem alterar a microbiota e reduzir a proteólise. Também deve-se considerar as inflamações intestinais que acarretam lesões vilositárias com consequente aumento da permeabilidade intestinal.

Figura 9- Ultramicrofotografia em grande aumento de 2 espécimes de enterócitos que sofreram diferentes tipo de tratamento experimental: 1- o da esquerda recebeu tratamento fisiológico e pode-se observar 2 enterócitos adjacentes com o espaço intercelular preservado (seta); 2- o da direita foi submetido a uma experimentação para romper a barreira de permeabilidade e permite observar a mancha enegrecida que corresponde a um produto de reação de uma proteína intacta ao longo do espaço intercelular. 

Doenças inflamatórias intestinais

No passado, muitos modelos experimentais responsabilizavam diversos agentes infecciosos como causa e fatores de exacerbação das doenças inflamatórias intestinais (DII). Estes estudos limitavam-se a serem observacionais e não eram investigados laboratorialmente. Por outro lado, atualmente, vem sendo investigada a perda da tolerância imune aos comensais bacterianos entéricos. Foi aventada a existência de uma hipótese que é fortemente justificada pela observação da peculiar flora entérica dos pacientes portadores de DII, a qual caracteriza-se por um aumento do número de bactérias agressivas, tais como Bacteroides, E. coli invasora e Enterococcus, e, também, por uma diminuição das bactérias protetoras, tais como, Lactobacillus e bifidobactérias.

Evidencias crescentes indicam que uma desregulação do sistema imune, geneticamente determinada, contra a flora bacteriana residente possa estar envolvida na patogênese das DII, porque biópsias realizadas neste grupo de pacientes, observaram-se que células T CD4+ representam a vasta maioria de células mononucleares infiltrando o intestino. Estes achados indicam que estas células CD4+ têm papel fundamental na patogênese do dano tissular na DII, especialmente na doença celíaca. Trata-se de um mecanismo que acarreta a ativação descontrolada de células T, mas que ainda não está completamente elucidado. Acredita-se que moléculas contra-reguladoras (TGF beta1, IL-10), envolvidas em manter a tolerância contra a flora residente apresentam uma atividade defeituosa (Figura 10).

Figura 10- Sub-grupos de células CD4+ no lumen do intestino delgado.

Doença de Crohn: um modelo de suscetibilidade genética

A suscetibilidade genética do hospedeiro, ganhou destaque após a descoberta da associação da doença de Crohn com mutações do gene NOD2. Pacientes com defeitos no NOD2 tem redução na expressão de alfa-defensinas antimicrobianas nas células de Paneth, com consequente alteração no reconhecimento bacteriano e controle da inflamação. Estas observações sugerem que o produto do gene NOD2 confere suscetibilidade à doença de Crohn, documentando assim um modelo molecular para o mecanismo patogénico da doença de Crohn, que pode agora ser adicionalmente investigado.

Tradicionalmente, a doença de Crohn tem sido associada a um perfil de citocinas Th1, enquanto que as citocinas Th2 são moduladores da colite ulcerativa. Este conceito tem sido desafiado pela descrição de células T reguladoras (Treg) e por células Th17 pró-inflamatórias, uma nova população de células T, caracterizada pela produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. Vários estudos demonstraram um papel importante das células Th17 na inflamação intestinal, particularmente na doença de Crohn. Investigações de associação do genoma indicam que existem genes envolvidos na diferenciação Th17 que estão associados com a susceptibilidade à doença de Crohn e em parte também com colite ulcerativa. Tomadas em conjunto, as células Th1 e Th17 são mediadoras importantes da inflamação na doença de Crohn. Estas investigações iniciais poderão levar ao conhecimento mais preciso do mecanismo de produção das DII.

Conclusões

Atualmente está plenamente demonstrado o papel fundamental do sistema imune intestinal na regulação do equilíbrio entre o organismo do hospedeiro e a microbiota que habita seu trato digestivo, evitando que ocorram situações patológicas em detrimento do bem estar de saúde do hospedeiro. Trata-se de um sistema altamente sofisticado que necessita a interação de inúmeros fatores para a preservação  da sua total integridade.

Até o presente momento há pouco consenso sobre o possível papel de proteção da barreira intestinal para a prevenção ou tratamento das DII. No entanto, várias medidas de proteção têm sido utilizados para melhorar a função da barreira intestinal, como o uso de antioxidantes, o fator de crescimento e a nutrição enteral.