terça-feira, 31 de março de 2015

Minha História de vida e minha História vivida na EPM/UNIFESP (32)

A história da realização de um Pós-Doutorado no North Shore University Hospital, Cornell University, Nova Iorque: pessoal e científica


O Típico Modelo Experimental da Enteropatia Ambiental

A presença das bactérias da flora colônica na luz do jejuno, ao superar os mecanismos fisiológicos existentes para seu controle em local adequado (íleo terminal e colon) como pode ocorrer em diversas situações clínicas, cujo exemplo mais marcante é o da Enteropatia Ambiental, provoca algumas anormalidades de forma direta e indireta.
As bactérias da flora colônica, em especial as anaeróbias, como por exemplo, Bacteróide e Veilonella, estando presentes na luz do intestino delgado alto passam a competir com o hospedeiro quanto ao melhor aproveitamento dos nutrientes da dieta, a saber: 1- Proteínas: as bactérias utilizam as proteínas da dieta para seu metabolismo próprio além da vitamina B12 e do ácido fólico, sendo que seus subprodutos são absorvidos pela mucosa intestinal e eliminados na urina sob a forma de Indican (Figura 1).
Figura 1- Representação esquemática da ação das bactérias sobre as proteínas e vitaminas da dieta.

2- Carboidratos: as bactérias utilizam os carboidratos da dieta para seu metabolismo próprio fermentando-os e transformando-os na luz do intestino delgado em ácidos orgânicos voláteis de cadeia pequena e média, tais como ácido láctico e acético. Estes ácidos orgânicos em parte serão absorvidos pela mucosa intestinal e serão eliminados pela respiração sob a forma de Hidrogênio, enquanto que outra parte permanece na luz do intestino e exerce importante efeito osmótico acarretando secreção de água desde o leito vascular para o interior do intestino provocando sintomas, tais como, diarreia, flatulência, distensão abdominal e cólicas (Figura 2).
Figura 2- Esquema da diarréia osmótica provocada pela má absorção dos carboidratos da dieta.

As bactérias podem também provocar alterações morfológicas nos enterócitos particularmente nas microvilosidades, região aonde se encontram as dissacaridases, enzimas responsáveis pela digestão dos dissacarídeos da dieta, levando à deficiência das mesmas. Pariticular importância refere-se à lactase, a mais vulnerável das dissacaridases, responsável pela digestão da lactose, o dissacarídeo encontrado praticamente apenas no leite. Naquelas crianças de tenra idade em que o leite representa um majoritário aporte nutricional, a deficiência de lactase pode resultar em efeitos colaterais dramáticos ocasionando diarreia crônica e importante agravo do estado nutricional (Figura 3);
Figura 3- Representação esquemática da ação das bactérias sobre as dissacaridases, em especial, sobre a lactase.

3- Gorduras: as bactérias podem atuar sobre os ácidos graxos das gorduras da dieta produzindo uma beta-hidroxilação dos mesmos. Este novo composto orgânico tem capacidade catártica e provoca irritação da mucosa colônica gerando diarreia (Figura 4).
Figura 4- Representação esquemática da ação das bactérias sobre os ácidos graxos componentes das gorduras da dieta, causando beta hidroxilação dos mesmos.
As bactérias colônicas podem provocar anormalidades na função digestivo-absortiva de forma indireta por sua atuação sobre os sais biliares primários, ácido cólico e quenodeoxicólico, desconjugando-os e 7 alfa desidroxilando-os, transformando-os em sais biliares secundários e desconjugados, ácido deoxicólico e ácido litocólico, os quais como já vimos anteriormente terão inúmeras ações lesivas morfofuncionais sobre a mucosa do intestino delgado.
O clássico exemplo clínico desta situação fisiopatológica está bem caracterizado nos pacientes portadores de Enteropatia Ambiental. São crianças que vivem em ambientes promíscuos socialmente vulneráveis em comunidades desprovidas de água potável e saneamento básico com elevados níveis de contaminação ambiental, como é a típica situação de vida em nossas favelas (Figuras 5 & 6).
Figura 5- Uma favela brasileira, verdadeira fossa negra a céu aberto, e as crianças brincando nas águas contaminadas.

Figura 6- Uma típica favela brasileira, esta no nosso Nordeste.

A Enteropatia Ambiental na prática: a volta ao Brasil e o trabalho de campo na Favela Cidade Leonor

Baseados nos achados desta investigação experimental, já de retorno ao Brasil, juntamente com meus estudantes de pós-graduação, nos dedicamos a um trabalho comunitário envolvendo crianças faveladas moradoras da favela Cidade Leonor, em São Paulo, aonde tivemos a oportunidade de confirmar os altos índices de desnutrição proteico-calórica (Figura 7), deficiente capacidade absortiva (Figura 8) e altas taxas de ocorrência de sobrecrescimento bacteriano no intestino delgado (Figura 9).
 
Figura 7- Classificação do estado nutricional das crianças por nosso grupo atendida na favela Cidade Leonor.
Figura 8- Deficiência da absorção da D-xilose em crianças da favela Cidade Leonor.

Figura 9- Sobrecrescimento bacteriano no intestino delgado em crianças da favela Cidade Leonor.

Este projeto de investigação representa um clássico exemplo de como os conhecimentos adquiridos por meio da pesquisa básica, nas bancadas dos laboratórios, utilizando animais de experimentação, a partir da elaboração de um modelo que reproduz situações vivenciadas na prática clínica, pode desvendar as consequências íntimas de um sem número de mecanismos fisiopatológicos, e, consequentemente propiciar as propostas de medidas de prevenção e tratamento adequados.

sexta-feira, 27 de março de 2015

Minha História de vida e minha História vivida na EPM/UNIFESP (31)

A história da realização de um Pós-Doutorado no North Shore University Hospital, Cornell University, Nova Iorque: pessoal e científica

A realização do projeto de Pesquisa Experimental: “Absorção de Macromoléculas Intactas Pelo Jejuno De Ratos in vivo: Influência Dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato”

Discussão

A- Mecanismos de Absorção da HRP Induzidos pelos Sais Biliares

O ponto central dos nossos experimentos refere-se ao fato de que modificações qualitativas e quantitativas dos sais biliares no microambiente jejunal podem acarretar alterações significativas sobre a barreira de permeabilidade intestinal favorecendo a absorção de macromoléculas proteicas potencialmente alergênicas. Neste estudo ficou plenamente demonstrado que a presença de sais biliares desconjugados no lumem do intestino delgado alto provoca aumento da absorção de um marcador macromolecular. Mais ainda, demonstramos que a magnitude desta captação, ao que tudo indica, parece depender do tipo do sal biliar, primário ou secundário, e seu estado químico, conjugado ou desconjugado.
Baseando-se na experiência de Berrant e cols., que demonstraram em ratos, que na vigência de sobrecrescimento bacteriano da flora colônica no intestino delgado alto os valores dos sais biliares desconjugados alcançam concentrações de até 1 mM, as condições do nosso experimento encontram-se plenamente compatíveis com situações fisiopatológicas.
Os mecanismos íntimos envolvidos nesta absorção aumentada da HRP podem variar dependendo de cada sal biliar em particular e seu estado químico, conjugado ou desconjugado. A absorção da HRP mostrou-se mais intensa com os sais biliares sob a forma desconjugada, em especial o sal biliar secundário Deoxicólico, onde as lesões ultra-estruturais aos sistemas de membranas celulares foram mais graves, incluindo o aparelho de Golgi, retículo endoplásmico e mitocôndria. Tem sido descrito que a presença de sais biliares desconjugados na luz do intestino delgado superior também provoca alterações funcionais sobre o transporte de água e sódio, assim como acarreta má absorção de glicose. Nossos achados indicam que sais biliares desconjugados lesam a integridade da barreira anteposta pela junção firme dos enterócitos permitindo, assim, a penetração do marcador proteico potencialmente alergênico desde o lúmen para a circulação sistêmica. Na mucosa intestinal normal as junções firmes, que constituem uma fusão apical das membranas plasmáticas laterais das células epiteliais adjacentes, constituem uma verdadeira barreira à penetração de macromoléculas desde o lúmen intestinal à circulação e vice-versa. Atualmente há nítidas evidências de que esta barreira pode ser destruída durante certas condições fisiopatológicas, tais como: infecções entéricas provocadas por certos agentes enteropatogênicos tais como as cepas entero-aderentes de Escherichia coli e as cêpas entero-agregativas de Escherichia coli, desnutrição proteico-calórica, trauma cirúrgico, ingestão crônica de álcool, condições de hiperosmolaridade etc.
B- Possíveis Implicações
Desnutrição e diarreia constituem um binômio praticamente inseparável contribuindo decisivamente como uma das principais causas de mortalidade infantil nos países em desenvolvimento.
Um aspecto peculiar da desnutrição proteico-calórica está representado pela alta frequência de sobrecrescimento da microflora colônica nas porções superiores do intestino delgado. A ruptura dos mecanismos reguladores da flora bacteriana, tais como, hipocloridria gástrica, hipomotilidade e hipotonia intestinais, deficiências imunológicas, etc., associados a condições ambientais insalubres, altamente contaminados devido à ausência de água potável e saneamento básico, propiciam o sobrecrescimento bacteriano e acarretam sérias consequências para o hospedeiro.
Bactérias intestinais, em especial as anaeróbias, atuam sobre os sais biliares primários, desconjugando-os, acarretando diminuição da concentração micelar crítica, impedindo a formação da micela mista. Como decorrência direta deste efeito ocorre deficiente solubilização dos gorduras da dieta, com consequente esteatorréia. Estas bactérias também possuem a capacidade de atuar sobre os sais biliares primários provocando 7 alfa desidroxilação (Figura 22), transformando-os em sais biliares secundários, o que irá desencadear graves alterações morfofuncionais no intestino delgado.
Figura 22- Representação esquemática da ação das bactérias anaeróbias sobre os sais biliares primários causando 7 alfa desidroxilação e desconjugação, transformando-os em sais biliares secundários.

Além disso, a associação dos sais biliares secundários e desconjugados com as bactérias anaeróbias presentes na luz do intestino delgado é altamente lesiva para a mucosa jejunal acarretando graves deficiências digestivo-absortivas que irão trazer repercussões indesejáveis para a saúde do indivíduo afetado por esta síndrome.
Em conclusão, absorção aumentada de macromoléculas proteicas intactas, potencialmente antigênicas, como foi observado nas condições definidas por este experimento, deve alertar para a possibilidade do aparecimento de alergia alimentar devido à ruptura da barreira de permeabilidade intestinal, mesmo levando-se em conta todas as reconhecidas possíveis limitações advindas de um estudo experimental e suas respectivas dificuldades de transposição para aquela vivenciada na atividade clínica.


quarta-feira, 18 de março de 2015

Minha História de vida e minha História vivida na EPM/UNIFESP (30)

A história da realização de um Pós-Doutorado no North Shore University Hospital, Cornell University, Nova Iorque: pessoal e científica

A realização do projeto de Pesquisa Experimental: “Absorção de Macromoléculas Intactas Pelo Jejuno De Ratos in vivo: Influência Dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato”

Material e Métodos

1. Perfusão Intestinal
Ratos machos, cêpa Wistar, pesando entre 100 e 150 gramas foram utilizados. Os ratos foram alimentados com dieta padrão até a noite anterior ao experimento.
Os ratos foram anestesiados pela via intra-peritoneal com uretano à dose de 1,2 g/kg de peso. A cavidade abdominal foi aberta por uma incisão médio-ventral e o duodeno identificado. Uma pequena incisão foi realizada na porção média do duodeno e um tubo de polietileno foi inserido através de uma incisão até atingir o ligamento de Treitz. A cânula foi então fixada no lugar por meio de uma ligadura. Um segmento de jejuno, medindo aproximadamente 30-40 cm, foi utilizado para perfusão e a extremidade distal deste segmento também foi canulada, a cânula foi fixada por uma ligadura. O segmento distal assim preparado para a perfusão intestinal foi delicadamente lavado com solução fisiológica isotônica evitando-se distensão da alça intestinal a ser perfundida (Figura 11).
Figura 11- Início do procedimento cirúrgico para implantação das cânulas; às vezes ocorria algum acidente de trabalho como mostra a foto.
A cânula proximal foi acoplada a uma bomba de perfusão peristáltica marca Harvard modelo 1220 e o segmento jejunal devidamente preparado foi perfundido durante 60 minutos a um ritmo de 0,21-0,24 ml/min com uma solução isotônica (280 mOsm/l) de glicose e cloreto de sódio (pH 6,9) contendo 600 mg% de polietileno-glicol (PEG) e 0,5 g% de Horseradish peroxidase (HRP) (Tipo II Sigma Chemical Co., St Louis, M) como marcador proteico macromolecular. A esta solução de perfusão foi acrescentada, de forma independente para cada sessão do experimento, o sal sódico de um dos seguintes ácidos biliares: Taurocólico (TCh) (Sal biliar primário e conjugado), Cólico (Ch) (Sal biliar primário e desconjugado) e Deoxicólico (DCh) (Sal biliar secundário e desconjugado) a uma concentração de 0,5 mM. Ratos Controles (C) foram perfundidos com uma solução isenta de sais biliares. Após a adição dos sais biliares o pH da solução foi reajustado para o valor de 6,9 e a osmolaridade permaneceu inalterada (Figura 12).
Figura 12- Os ratos em plena seção de perfusão intestinal após terem sido apropriadamente preparados para tal com as cânulas proximais acopladas às bombas de perfusão. Cada experimento envolvia 12 ratos em um mesmo procedimento.
A concentração 0,5 mM dos sais biliares foi escolhida por ser aquela que fisiologicamente se encontra no lúmen intestinal dos ratos adultos. Foram estudados os fluxos de água por meio da determinação das alterações intra-luminais de um marcador não absorvível, o PEG, durante o experimento, expressos segundo a seguinte relação PEG inicial/PEG final, ou seja determinando-se o quociente entre a concentração do PEG na solução infundida e a concentração do PEG na solução coletada da perfusão na cânula distal. O transporte do sódio foi analisado determinando-se a concentração do sódio perfundido em aparelho de fotometria de chama (IL Modelo 143) e a absorção de glicose pelo método da glicose oxidase. Os cálculos finais dos transportes de sódio e glicose foram determinados aplicando-se a seguinte fórmula: T= C inicial – (C final x PEGr) x Ritmo de perfusão (ml/min) x 1000/ Comprimento de alça intestinal perfundida (cm), aonde: C inicial representa a concentração da substância na solução de perfusão e C final a concentração da substância no perfundido e PEGr o valor numérico da relação PEG inicial/PEG finalValores finais positivos indicam absorção de uma determinada substância e negativos indicam secreção.
2. Análise Bioquímica da Absorção de HRP
A absorção de HRP desde a luz intestinal para a circulação sistêmica foi monitorada enzimaticamente. Ao cabo dos 60 minutos do período experimental, sangue da aorta abdominal foi cuidadosamente obtido, evitando-se hemólise. Este procedimento foi feito empregando-se uma agulha número 22 e seringa heparinizada da qual se retirou o êmbulo para que o sangue pudesse fluir espontaneamente. A agulha era então removida e permitia-se que o sangue fluísse da seringa para um tubo de ensaio conservado em um balde com gelo. O plasma era separado por centrifugação a 500g durante 10 minutos e posteriormente clarificado por uma segunda centrifugação sob idênticas condições (Figura 13).
Figura 13- Mary Ann fazendo a coleta de sangue da aorta do rato ao término do experimento de perfusão para fazer a dosagem sérica da HRP. Estou ao seu lado e há um buraco esbranquiçado na minha calça, produto de manipular substâncias corrosivas no laboratório.
A atividade sérica de HRP foi determinada utilizando-se orto-dianisidina (corante) como doadora de electron (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Os resultados foram expressos como micromoles de peroxidase decomposta/min/ml/cm de jejuno perfundido e corrigido para um padrão de ritmo de perfusão de 0,2 ml/min. A reação enzimática obedece ao seguinte princípio básico: a peroxidase (enzima) atua sobre o peróxido de hidrogênio (substrato) decompondo-o em água e liberando oxigênio. A orto-dianisidina é uma substância incolor que foi adicionada à reação para possibilitar a quantificação da atividade enzimática. À medida que a reação se processa, o corante é oxidado pela liberação de Oxigênio molecular e vai adquirindo a cor marrom. Desta forma, torna-se possível determinar por método colorimétrico, empregando-se espectrofotômetro com polígrafo acoplado, a quantidade de enzima presente na amostra estudada (Figura 14).
Figura 14- Mary Ann carregando a prateleira com os tubos de ensaio após ter dosado a HRP por técnica bioquímica. Notar o tom amarronzado do fluido no interior dos tubos de ensaio.

3. Microscopia de Luz e Eletrônica de Transmissão
A absorção de HRP foi também monitorada utilizando-se método citoquímico por meio da microscopia de luz e eletrônica de transmissão conforme descrição que segue abaixo.
Após a conclusão do experimento, o segmento intestinal foi perfundido durante aproximadamente 3 minutos, a um ritmo de 10 ml/min à temperatura ambiente, com solução de glutaraldeido 2% tamponada com cacodilato 0,1 (pH 7,2 – 7,4). Após este tempo os ratos eram sacrificados, o segmento perfundido retirado e submerso em fixador refrigerado, recentemente preparado. Uma pequena porção deste material, medindo de 2 a 3 cm de tamanho, distando de 10 a 15 cm da porta de entrada da cânula proximal era obtido e dividido em pequenos blocos de tecido de forma cilíndrica. Estes blocos eram submersos em frasco contendo a solução fixadora e aí permaneciam por uma hora. Após este período de tempo os fragmentos eram lavados durante 12 horas em solução tampão cacodilato 0,1 M com 7% de sacarose e guardados em refrigerador.
Os fragmentos cilíndricos eram agora abertos, cortados em porções menores sob microscópio de dissecção em tampão refrigerado, expondo-se assim a face luminal da mucosa jejunal. Estes novos fragmentos eram congelados na cabeça de um micrótomo de congelação, enxaguados durante 15 minutos no meio de Graham e Karnovsky contendo diamino-benzidina em ausência de substrato (peróxido de Hidrogênio). Eram posteriormente incubados durante 45 minutos em meio completo à temperatura ambiente.
O processo de incubação enzimática era finalizado enxaguando-se brevemente com solução refrigerada de sacarose 7,5%.
Os fragmentos incubados eram posteriormente fixados em solução refrigerada de tetraóxido de ósmio contendo tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,3) durante 60 minutos, corados em bloco com acetato de uranila, desidratados em uma série graduada de soluções de etanol a 50, 70, 95 e 100%, respectivamente, e, finalmente incluídos em Epon. Cortes espessos de 1 micra eram feitos em ultramicrótomo para estudo em microscópio de fase (Figura 15).
Figura 15- Microfotografia em microscópio de contraste de fase mostrando 2 vilosidades jejunais digitiformes aonde podem ser visualizadas as células epiteliais cilíndricas e as células califormes. Na superfície mais externa das vilosidades, na região das microvilosidades, nota-se um contorno enegrecido que corresponde à presença do produto de reação da HRP (macro-molécula proteica).
Cortes ultrafinos de coloração prateada eram feitos e examinados em microscópio eletrônico JEOL-JEM 100. Os espécimes eram estudados levemente corados com citrato de chumbo. Microfotografias eram obtidas em magnificações iniciais de 5000 a 25000 vezes.
As análises histológicas dos cortes espessos eram feitas “às cegas” desconhecendo-se o tipo de tratamento fisiológico ao qual o material havia sido submetido e interpretadas por 2 investigadores (eu e Saul Teichberg). Nenhum resultado foi considerado válido caso não fosse reprodutível em pelo menos 3 experimentos independentes. Para cada um dos ratos estudados, 18-24 vilosidades intestinais por animal foram analisadas em microscopia de fase. Áreas representativas foram escolhidas para análise em microscopia eletrônica.
Resultados
1Análise Bioquímica da Absorção da Horse Radish Peroxidase (HRP)
A absorção de HRP mostrou-se significantemente mais elevada que os níveis observados para o grupo controle somente quando a solução de perfusão continha o sal biliar primário desconjugado (Cólico) e o sal biliar secundário e desconjugado (Deoxicólico). Outrossim, a absorção de HRP se revelou mais intensa ainda quando a solução de perfusão continha o sal biliar secundário e desconjugado. Não houve diferenças significativas nos níveis séricos da HRP entre os ratos controles perfundidos com solução glico-salina isenta de sais biliares e nos ratos perfundidos com o sal biliar primário e conjugado Taurocólico (fisiológico) (Tabela 1).

2Microscopia Eletrônica de Transmissão
A penetração de HRP através do epitélio intestinal foi citoquimicamente demonstrável após a perfusão intestinal com o sal biliar primário desconjugado (Cólico) e com o sal biliar secundário desconjugado (Deoxicólico). Nestas preparações a HRP foi visualizada nos espaços intercelulares entre 2 enterócitos adjacentes (Figura 16), bem como ao longo de toda a região das microvilosidades, na zona terminal no interior de vesículas endocitóticas e corpos multivesiculares, ao longo da membrana basal das células epiteliais e nos capilares da lâmina própria (Figuras 17-18).
Figura 16- Ultramicrofotografia de 2 enterócitos adjacentes de uma preparação perfundida com DCh. O produto de reação da HRP (em negro) é encontrado sobre as microvilosidades (v) e no espaço intercelular (e). A mitocôndria (m) aparece morfologicamente intacta. No detalhe, Figura 1a, o produto de reação da HRP (negro) é encontrado ao longo de todo o espaço intercelular (e) inclusive com ruptura da zona da junção firme (t). Na Figura 1b o produto de reação da HRP (negro) preserva a região da junção firme.
Figura 17- Ultramicrofotografia de um enterócito de uma preparação perfundida com DCh. O produto de reação da HRP (negro) encontra-se sobre as microvilosidades, as quais estão diminuidas em altura e ao longo do espaço intercelular. Notar no detalhe que as mitocôndrias (m) e o aparelho de Gogi (g) encontram-se inchados e deformados.
Figura 18- Ultramicrofotografia de uma preparação perfundida com DCh. Notar no centro da foto uma estrutura bizarra arredondada com a presença no seu interior do produto de reação da HRP (negro). Trata-se de um corpo multivesicular que caracteriza a atividade lisosomal intracitoplasmática com destruição da macromolécula.
Em todas as preparações nas quais houve penetração da HRP na lâmina própria o marcador protéico também foi detectado no interior dos capilares. O endotélio capilar é fenestrado e a HRP foi visualizada no interior dos capilares venosos (Figura 19).
Figura 19- Ultramicrofotografia de uma preparação perfundida com Ch. Nota-se o produto de reação da HRP (negro) no interior de um capilar venoso da lâmina própria (c), desde o espaça intercelular (e). Notar em (r) uma hemácia e em (f) um fibroblasto

Com o sal biliar primário e conjugado, Taurocólico, a absorção de HRP foi raramente demonstrada, pelo método citoquímico empregado, em apenas umas poucas vesículas endocitóticas e corpos multivesiculares; o marcador protéico manteve-se confinado às microvilosidades e ocasionalmente pode-se comprovar alguns depósitos focais do produto de reação da HRP nas regiões mais profundas dos espaços intercelulares (Figura 20). Os mesmos achados também foram observados no grupo controle.
Figura 20- Ultramicrofotografia de 2 enterócitos adjacentes de uma preparação perfundida com TCh. O produto de reação da HRP (negro) encontra-se inteiramente confinado na região das microvilosidades (v). Notar que o espaço intercelular (e) encontra-se praticamente desprovido do produto de reação da HRP e que as mitocôndrias (m) e os retículos endoplásmicos (r) encontram-se totalmente intactos e preservados.

quinta-feira, 12 de março de 2015

Minha História de vida e minha História vivida na EPM/UNIFESP (29)

A história da realização de um Pós-Doutorado no North Shore University Hospital, Cornell University, Nova Iorque: pessoal e científica


A realização do projeto de Pesquisa Experimental: “Absorção de Macromoléculas Intactas Pelo Jejuno De Ratos in vivo: Influência Dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato”
Introdução
A- Absorção de Macromoléculas pelo Intestino e sua Relação com Alergia Alimentar

A despeito da noção geral de que o intestino se constitui em uma barreira impermeável à penetração dos antígenos intra-luminais, evidências clínicas e experimentais demonstram que esta barreira da mucosa intestinal pode ser eventualmente ultrapassada mesmo em determinadas circunstâncias não patológicas. Desta forma, a absorção de macromoléculas pode ocorrer, ainda que seja em quantidades ínfimas para que tenha algum valor nutricional, mas que seja em quantidades de tal monta que possam ser suficientes para desenvolver estímulo antigênico.
A absorção aumentada de macromoléculas intactas pelo intestino pode acarretar uma série de consequências indesejáveis para o hospedeiro. Por exemplo, está plenamente reconhecida que a absorção de macromoléculas pode desempenhar papel de fundamental importância em algumas situações patológicas nas quais se incluem as reações alérgicas aos alimentos, diarreia crônica, processos toxigênicos, enfermidades inflamatórias intestinais, doença celíaca, enfermidades autoimunes, etc.
Para impedir a penetração antigênica para a corrente sanguínea através da barreira mucosa intestinal, a natureza criou um sofisticado sistema de defesa, imunológico e não imunológico (físico e químico), que atua desde o estômago avançando para o lúmen intestinal, até mesmo recobrindo a superfície mucosa (glicocálix), provendo, assim, o trato digestivo como a primeira linha de defesa contra este tipo de invasão (Figuras 1–2–3–4–5-6) (Tabela 1).
Tabela 1- Componentes da Barreira de Permeabilidade Intestinal.
Figura 1- Desenho esquemático da distribuição da microflora bacteriana ao longo do trato digestivo em condições fisiológicas.
Figura 2- Desenho esquemático da distribuição do muco na superfície do enterócito.
Figura 3- Ultramicrofotografia de uma célula caliciforme repleta de muco em seu interior.
Figura 4- Desenho esquemático da barreira de permeabilidade interposta pelo poro intercelular, pela junção firme e pelos desmosomas.
Figura 5- Ultramicrofotografia de dois enterócitos adjacentes evidenciando a região das microvilosidades no polo apical das células e o espaço intercelular mostrando em seu terço médio um desmosoma (mancha enegrecida).
Figura 6- Desenho esquemático dos diversos componentes da barreira de permeabilidade em condições normais e da deficiência de um ou mais destes componentes.

Entretanto, apesar da existência desta eficiente barreira de permeabilidade, nem sempre, porém, o organismo consegue depurar completamente os antígenos ingeridos com a dieta. Nestas últimas décadas inúmeros estudos experimentais combinados, morfológicos e funcionais, revelaram que o enterócito possui a capacidade de absorver macromoléculas intactas que por quaisquer motivos conseguiram alcançar a porção mais apical na região das microvilosidades. Por meio de um sistema de vesículas, inicialmente ocorre uma interação entre as macromoléculas e os componentes da membrana das microvilosidades (Figura 7), processo denominado “adsorção”.
Figura 7- Desenho esquemático do processo de endocitose e o estímulo de produção de lisosomas pelo complexo de Golgi com a respectiva formação do corpo mulivescular.
Quando uma concentração suficientemente significativa de macromoléculas entra em contato com a membrana celular ocorre uma invaginação da mesma (endocitose), desta vez, pequenas vesículas endocitóticas são formadas na base apical das microvilosidades, as quais, posteriormente, dirigem-se para o polo basal do enterócito. Uma fração destas vesículas endocitóticas funde-se com os lisosomas produzidos pelo complexo de Golgi dando lugar a formação dos corpos multivesiculares, os quais já não mais possuem efeito antigênico (Figura 8).

Figura 8- Ultramicrofotografia de um corpo multivesicular que foi fagocitado e destruido pelo lisosoma no interior do enterócito.

Este complexo é eliminado no espaço intercelular através do pólo baso-lateral do enterócito por meio de um processo denominado exocitose (Figura 9), o qual já está suficientemente degradado, portanto, sem capacidade de desenvolver qualquer estímulo antigênico, este evento representa a primeira linha de defesa celular.
Figura 9- Desenho esquemático do processo de destruição da macromolécula pelo lisosoma e sua eliminação do enterócito por meio da exocitose, agora já sem possibilidade de desenvolver estímulo antigênico.
Caso, porém, parte do material que sofreu o processo de endocitose não venha a ser totalmente degradado pelos lisosomas e seja liberado intacto pelo enterócito, este material será degradado por macrófagos que estão presentes na lâmina própria da mucosa do intestino delgado, os quais representam a segunda linha de defesa celular. Por outro lado, entretanto, caso ocorra uma penetração significativa de macromoléculas intactas, potencialmente antigênicas, que venham a superar todos os mecanismos de defesa do trato digestivo e haja uma predisposição alérgica geneticamente determinada por parte do hospedeiro, poderão surgir as clássicas manifestações clínicas de Alergia Alimentar.
 Objetivos
Está bem estabelecido que em condições fisiológicas os sais biliares primários estão presentes no fluido do intestino delgado como compostos químicos conjugados com glicina ou taurina, e que a produção dos sais biliares secundários se dá pela ação das bactérias da microflora intestinal, as quais se encontram em concentrações elevadas a partir das porções distais do intestino delgado, em particular no íleo terminal. Por outro lado, em situações patológicas em que ocorre sobrecrescimento bacteriano da microflora colônica nas porções altas do intestino delgado, haverá não somente desconjugação dos sais biliares primários, como também produção de sais biliares secundários pela 7α desidroxilação dos sais biliares primários. Tem sido demonstrado que a presença de sais biliares desconjugados e/ou secundários na luz do jejuno resulta em efeitos altamente deletérios sobre a função digestivo-absortiva provocando secreção de água e sódio, má absorção de glicose e alterações morfológicas na mucosa jejunal (Figura 10). Levando-se em consideração estas anormalidades acima descritas, este projeto de pesquisa experimental foi desenvolvido para avaliar os potenciais efeitos, sobre a barreira de permeabilidade intestinal, dos seguintes sais biliares: taurocolato (primário e conjugado), cólico (primário e desconjugado) e deoxicólico (secundário e desconjugado).
Figura 10- Ação deletéria dos sais biliares
desconjugados sobre a mucosa do intestino delgado. 

segunda-feira, 2 de março de 2015

Minha História de vida e minha História vivida na EPM/UNIFESP (28)

A história da realização de um Pós-Doutorado no North Shore University Hospital, Cornell University, Nova Iorque: pessoal e científica


O Pós-Doutorado: Um Projeto de Pesquisa Experimental

Introdução 

A-  Aspectos de Importância da Fisiologia dos Sais Biliares


A bile é uma solução aquosa complexa, constituída por compostos orgânicos e inorgânicos e que se encontra armazenada na vesícula biliar. Sua composição, cor, fluxo, viscosidade e conteúdo sólido totais variam largamente durante o decorrer do dia, assim como de uma espécie para outra (Figura 1). 


Figura 1- Representação esquemática do ciclo de produção da bile a partir do fígado, armazenamento na vesícula biliar, liberação no duodeno e respectiva reabsorção no íleo terminal.


Quando a bile alcança o duodeno uma grande proporção dos seus constituintes não estará irreversivelmente perdida nas fezes, ao contrário, em condições normais estará destinada a ser reabsorvida, retornará ao fígado e será reexcretada na bile.


Os sais biliares e a bilirrubina são produzidos no fígado e constituem 2 dos mais importantes solutos orgânicos componentes da bile; são também típicos exemplos do mecanismo do reaproveitamento anteriormente mencionado, muito embora se deem por vias distintas e independentes entre si. Os outros componentes orgânicos da bile são o colesterol e os fosfolípides, em especial a lecitina (Figura 2).
Figura 2- Visão esquemática da cara posterior do fígado evidenciando a localização da vesícula biliar.

Os sais biliares vêm despertando a curiosidade dos químicos, bioquímicos, fisiologistas e médicos há mais de 150 anos. Como resultado direto deste interesse uma avalanche de conhecimentos sobre a natureza química e física dos sais biliares tem se acumulado na literatura científica. Entretanto, somente nestas últimas décadas têm sido descritos estados de enfermidade que são causados diretamente pelos sais biliares, ou então, de forma indireta, como resultado das alterações do seu metabolismo e/ou fisiologia, particularmente causadas pela degradação da microflora bacteriana intestinal sobre os mesmos.

No fígado do ser humano, a partir da molécula do Colesterol são sintetizados 2 tipos de sais biliares, por isto são chamados Primários, a saber: Ácido Cólico (Figura 3) e Ácido Quenodeoxicólico.


Figura 3- Estrutura química do Ácido Cólico, sal biliar primário.

Os sais biliares constituem-se em compostos de 24 átomos de Carbono que possuem um núcleo com a configuração do ciclopentanoperhidrofenantreno, derivado do Colesterol. A cadeia lateral contém 5 átomos de Carbono que termina em grupo Carboxila (OH) e que se comporta como ácido orgânico, daí o nome Ácido Biliar; recebe a inclusão de um ou dois radicais hidroxilas (OH) em posições 7α e 12α. O Ácido Cólico é tri-hidroxilado (ácido 3α, 7α e 12α, trihidroxi, 5β colanóico) e o Ácido Quenodeoxicólico é dihidroxilado (ácido 3α e7α, dihidroxi, 5β colanóico). Os sais biliares estão ligados em forma peptídica com glicina e/ou taurina e a relação entre os compostos conjugados glicina/taurina se faz na proporção de 3:1. Este tipo de conjugação se dá no hepatócito via CoA e tem por objetivo proporcionar um aumento da solubilidade dos sais biliares em sistemas aquosos porque abaixa sua constante de dissociação. Os valores de pK destes conjugados são mais baixos do que o pH do conteúdo intestinal, por esta razão, os Ácidos Biliares existem no nosso organismo sob a forma de Sais de Sódio ou Potássio, por este motivo são denominados Sais Biliares (Figura 4).

 
Figura 4- Estrutura química dos ácidos biliares primários e secundários. Observar nas cadeias laterais a conjugação com glicina ou taurina.

Nos vertebrados a molécula do colesterol é o mais importante constituinte das membranas celulares, e a maioria dos tecidos do organismo sintetiza colesterol continuamente. A retenção excessiva do colesterol está associada a elevadas taxas do colesterol sérico e doença arterial. Assim sendo, torna-se necessário que o organismo disponha de meios apropriados para provocar a eliminação do excesso do colesterol sérico. Este objetivo é alcançado quimicamente pela conversão do colesterol em seus derivados hidrossolúveis, os sais biliares, os quais são secretados com a bile. Além disso, esta função é também fisicamente executada pela excreção do colesterol como tal, que passa a formar um complexo micelar constituído por sais biliares-lecitina-colesterol. Como se pode depreender os sais biliares são praticamente os únicos responsáveis pela excreção do colesterol do organismo; além de serem sintetizados a partir da molécula do colesterol atuam diretamente no seu transporte, criando as condições propicias de solubilização para eliminar seu precursor do organismo. Os sais biliares também induzem o fluxo biliar, isto é, estimulam o movimento dos fluidos durante sua secreção para o interior dos canalículos biliares, ainda dentro do parênquima hepático. Além disso, um eficiente sistema de transporte para a circulação sistêmica, localizado no íleo terminal, possibilita conservar a maior parte das moléculas dos sais biliares, posto que estes retornam ao fígado, e são novamente secretados na bile. Este processo é denominado Circulação Entero-Hepática o qual permite, por um lado, reciclar os sais biliares, e de outra parte, de forma concomitante, controlar a excreção do colesterol (Figuras 5-6).
Figura 5- Representação esquemática da circulação entero-hepática.

Figura 6- Visão das estruturas anatômicas componentes da circulação entero-hepática.

A existência da circulação entero-hepática assegura a manutenção de uma concentração ideal dos sais biliares no organismo. Os sais biliares participam da circulação entero-hepática sob 2 formas de estrutura química, a saber: 1- sais biliares primários, Ácido Cólico e Ácido Quenodeoxicólico; 2- sais biliares secundários, Ácido Deoxicólico (ácido 3α e 12α, dihidroxi, 5β colanóico) e Ácido Litocólico (ácido 3α hidroxi, 5β colanóico), os quais são formados no íleo terminal a partir dos sais biliares primários decorrentes de uma mudança estrutural denominada 7-alfa desidroxilação, por ação das bactérias componentes da microflora normal, em especial as anaeróbias (Figuras 7-8).

 
Figura 7- Transformação do sal biliar primário Colato em sal biliar secundário Deoxicolato pela ação da enzima bacteriana acarretando a 7 alfa desidroxilação (em vermelho).


Figura 8- Estruturas químicas dos sais biliares primários (Cólico e Quenodeoxicólico) e secundários (Litocólico e Deoxicólico).

Ácido Deoxicólico é prontamente absorvido a partir do íleo e do colon, retorna ao fígado aonde é reconjugado e secretado na bile, perfazendo cerca de 20% do total dos sais biliares, enquanto que o Ácido Litocólico é pouco solúvel à temperatura corporal, é absorvido em mínimas quantidades, sua maior parte é excretada nas fezes. A circulação entero-hepática é mantida por 2 bombas químicas, as quais extraem eficientemente os sais biliares e transportam-nos em sentido unidirecional. A primeira delas localiza-se no fígado e é responsável pela extraordinária rapidez pela qual os sais biliares retornam ao fígado, são extraídos do plasma e reexcretados na bile. A segunda bomba química está localizada no íleo terminal que remove 95% dos sais biliares que atingem esta porção do intestino e transporta-os para a circulação portal. Desta forma somente até 5% dos sais biliares sintetizados no fígado são eliminados nas fezes. Além dessas 2 bombas químicas, a vesícula biliar e o intestino delgado podem ser também considerados como bombas físicas.

Estima-se que o “pool” de sais biliares realiza a circulação entero-hepática 10 vezes por dia. Um indivíduo normal apresenta um “pool” de sais biliares de aproximadamente 3,5g e a circulação entero-hepática deste “pool” é da ordem de 35.000mg/24 horas.

Ao atingir o íleo terminal, cerca de 25% dos sais biliares primários conjugados com taurina ou glicina sofrem desconjugação por ação da flora bacteriana, principalmente anaeróbia, a qual existe em concentração elevada (aproximadamente 10 elevada a 9 colonias/ml de secreção ileal). Por outro lado, a maior parte destes sais biliares desconjugados é reabsorvida, retorna ao fígado e é novamente conjugada com glicina e/ou taurina dando sequência, assim, a seu ciclo diário de circulação.

A função mais importante dos sais biliares é, indiscutivelmente, criar um meio ambiente propício no lúmen jejunal para favorecer a solubilização das gorduras ingeridas com a dieta e assim permitir que o processo de digestão das mesmas se realize com máximo aproveitamento. Esta propriedade particular dos sais biliares primários está diretamente relacionada com sua capacidade de “detergência”. Detergentes são compostos químicos que apresentam dupla atividade, ou seja, uma porção da sua molécula interage de forma efetiva com a água (fração hidrofílica) ao passo que a outra porção o faz de forma débil (fração hidrofóbica). No caso dos sais biliares, as hidroxilas (radicais OH) e a cadeia lateral são hidrofílicas, ao passo que a estrutura esteróide é hidrofóbica (Figura 9).


Figura 9- Representação esquemática dos polos hidrofílicos e hidrofóbicos dos sais biliares.

Em baixas concentrações as moléculas dos sais biliares encontram-se dispersas em solução, mas em concentrações mais elevadas e dependendo de certas condições basais do fluido intestinal (pH, temperatura etc.) ao atingir a denominada concentração micelar crítica começa a ocorrer uma agregação molecular. Estes agregados são denominados micelas (Figura 10).

Figura 10- Representação esquemática da formação da micela.

Em condições fisiológicas a concentração micelar crítica encontra-se ao redor de 1 a 3 mM, e, em adultos normais, a concentração dos sais biliares varia de 5 a 25 mM; por outro lado, em recém-nascidos e nos primeiros meses de vida esta concentração é significativamente mais baixa, ao redor de 1,2 a 3 mM. A criação da fase micelar juntamente com a solubilização dos compostos de gordura acelera a reação lipolítica (digestão da gordura) no sentido de sua completa realização e, ao mesmo tempo, aumenta consideravelmente a disponibilidade da gordura já digerida pela lípase pancreática sob a forma de glicerol e ácidos graxos (reação de desesterificação) para ser absorvida pelos enterócitos do jejuno (Figura 11).


Figura 11- Representação esquemática do processo de digestão das gorduras da dieta.

No interior dos enterócitos irá ocorrer a reação de re-esterificação, ou seja, volta a ser formada a união do glicerol com os ácidos graxos (gordura), que serão transportados na circulação sanguínea pela veia porta em direção ao fígado ligados pela β-lipoproteina, fechando-se o ciclo da digestão-absorção das gorduras (Figura 12).

 
Figura 12- Representação esquemática do processo absortivo do colesterol, dos ácidos graxos e dos monoglicerídeos.

Pode-se, portanto, depreender que os sais biliares desempenham algumas funções de extrema importância para que os processos digestivo-absortivos se deem de forma plena e além disso têm também crucial papel no controle dos níveis séricos do colesterol no organismo humano. Por outro lado, alterações patológicas na localização da microflora bacteriana do trato digestivo interferem diretamente nos mecanismos fisiológicos acima descritos e irão provocar inúmeros efeitos colaterais indesejáveis para o organismo, sobre os quais versou este projeto de pesquisa experimental.