A história da realização de um Pós-Doutorado na Cornell University, Nova Iorque (12)

O Projeto de Pesquisa Experimental: “Absorção de Macromoléculas Intactas Pelo Jejuno De Ratos in vivo: Influência Dos Sais Biliares Taurocolato, Colato e Deoxicolato”

Resultados

1. Análise Bioquímica da Absorção da Horse Radish Peroxidase (HRP)

A absorção de HRP mostrou-se significantemente mais elevada que os níveis observados para o grupo controle somente quando a solução de perfusão continha o sal biliar primário desconjugado (Cólico) e o sal biliar secundário e desconjugado (Deoxicólico). Outrossim, a absorção de HRP se revelou mais intensa ainda quando a solução de perfusão continha o sal biliar secundário e desconjugado. Não houve diferenças significativas nos níveis séricos da HRP entre os ratos controles perfundidos com solução glico-salina isenta de sais biliares e nos ratos perfundidos com o sal biliar primário e conjugado Taurocólico (fisiológico) (Tabela 1).

2. Microscopia Eletrônica de Transmissão

A penetração de HRP através do epitélio intestinal foi citoquimicamente demonstrável após a perfusão intestinal com o sal biliar primário desconjugado (Cólico) e com o sal biliar secundário desconjugado (Deoxicólico). Nestas preparações a HRP foi visualizada nos espaços intercelulares entre 2 enterócitos adjacentes (Figura 1), bem como ao longo de toda a região das microvilosidades, na zona terminal no interior de vesículas endocitóticas e corpos multivesiculares, ao longo da membrana basal das células epiteliais e nos capilares da lâmina própria (Figuras 2 & 3).

Figura 1- Ultramicrofotografia de 2 enterócitos adjacentes de uma preparação perfundida com DCh. O produto de reação da HRP (em negro) é encontrado sobre as microvilosidades (v) e no espaço intercelular (e). A mitocôndria (m) aparece morfologicamente intacta. No detalhe, Figura 1a, o produto de reação da HRP (negro) é encontrado ao longo de todo o espaço intercelular (e) inclusive com ruptura da zona da junção firme (t). Na Figura 1b o produto de reação da HRP (negro) preserva a região da junção firme.

Figura 2- Ultramicrofotografia de um enterócito de uma preparação perfundida com DCh. O produto de reação da HRP (negro) encontra-se sobre as microvilosidades, as quais estão diminuidas em altura e ao longo do espaço intercelular. Notar no detalhe que as mitocôndrias (m) e o aparelho de Gogi (g) encontram-se inchados e deformados.

Figura 3- Ultramicrofotografia de uma preparação perfundida com DCh. Notar no centro da foto uma estrutura bizarra arredondada com a presença no seu interior do produto de reação da HRP (negro). Trata-se de um corpo multivesicular que caracteriza a atividade lisosomal intracitoplasmática com destruição da macromolécula.

Em todas as preparações nas quais houve penetração da HRP na lâmina própria o marcador protéico também foi detectado no interior dos capilares. O endotélio capilar é fenestrado e a HRP foi visualizada no interior dos capilares venosos (Figura 4).

. Figura 4- Ultramicrofotografia de uma preparação perfundida com Ch. Nota-se o produto de reação da HRP (negro) no interior de um capilar venoso da lâmina própria (c), desde o espaça intercelular (e). Notar em (r) uma hemácia e em (f) um fibroblasto

Com o sal biliar primário e conjugado, Taurocólico, a absorção de HRP foi raramente demonstrada, pelo método citoquímico empregado, em apenas umas poucas vesículas endocitóticas e corpos multivesiculares; o marcador protéico manteve-se confinado às microvilosidades e ocasionalmente pode-se comprovar alguns depósitos focais do produto de reação da HRP nas regiões mais profundas dos espaços intercelulares (Figura 5). Os mesmos achados também foram observados no grupo controle.

Figura 5- Ultramicrofotografia de 2 enterócitos adjacentes de uma preparação perfundida com TCh. O produto de reação da HRP (negro) encontra-se inteiramente confinado na região das microvilosidades (v). Notar que o espaço intercelular (e) encontra-se praticamente desprovido do produto de reação da HRP e que as mitocôndrias (m) e os retículos endoplásmicos (r) encontram-se totalmente intactos e preservados.

Discussão

A- Mecanismos de Absorção da HRP Induzidos pelos Sais Biliares

O ponto central dos nossos experimentos refere-se ao fato de que modificações qualitativas e quantitativas dos sais biliares no micro-ambiente jejunal podem acarretar alterações significativas sobre a barreira de permeabilidade intestinal favorecendo a absorção de macromoléculas protéicas potencialmente alergênicas. Neste estudo ficou plenamente demonstrado que a presença de sais biliares desconjugados no lumem do intestino delgado alto provoca aumento da absorção de um marcador macromolecular. Mais ainda, demonstramos que a magnitude desta captação, ao que tudo indica, parece depender do tipo do sal biliar, primário ou secundário, e seu estado químico, conjugado ou desconjugado.

Baseando-se na experiência de Berrant e cols., que demonstraram em ratos, que na vigência de sobrecrescimento bacteriano da flora colônica no intestino delgado alto os valores dos sais biliares desconjugados alcançam concentrações de até 1 mM, as condições do nosso experimento encontram-se plenamente compatíveis com situações fisiopatológicas.

Os mecanismos íntimos envolvidos nesta absorção aumentada da HRP podem variar dependendo de cada sal biliar em particular e seu estado químico, conjugado ou desconjugado. A absorção da HRP mostrou-se mais intensa com os sais biliares sob a forma desconjugada, em especial o sal biliar secundário Deoxicólico, onde as lesões ultra-estruturais aos sistemas de membranas celulares foram mais graves, incluindo o aparelho de Golgi, retículo endoplásmico e mitocôndria (Figura 2). Tem sido descrito que a presença de sais biliares desconjugados na luz do intestino delgado superior também provoca alterações funcionais sobre o transporte de água e sódio, assim como acarreta má absorção de glicose. Nossos achados indicam que sais biliares desconjugados lesam a integridade da barreira anteposta pela junção firme dos enterócitos permitindo, assim, a penetração do marcador protéico potencialmente alergênico desde o lúmen para a circulação sistêmica. Na mucosa intestinal normal as junções firmes, que constituem uma fusão apical das membranas plasmáticas laterais das células epiteliais adjacentes, constituem uma verdadeira barreira à penetração de macromoléculas desde o lúmen intestinal à circulação e vice-versa. Atualmente há nítidas evidências de que esta barreira pode ser destruída durante certas condições fisiopatológicas, tais como: infecções entéricas provocadas por certos agentes enteropatogênicos tais como as cêpas entero-aderentes de Escherichia coli e as cêpas entero-agregativas de Escherichia coli, desnutrição protéico-calórica, trauma cirúrgico, ingestão crônica de álcool, condições de hiperosmolaridade etc.

B- Possíveis Implicações

Desnutrição e diarréia constituem um binômio praticamente inseparável contribuindo decisivamente como uma das principais causas de mortalidade infantil nos países em desenvolvimento.

Um aspecto peculiar da desnutrição protéico-calórica está representado pela alta freqüência de sobrecrescimento da microflora colônica nas porções superiores do intestino delgado. A ruptura dos mecanismos reguladores da flora bacteriana, tais como, hipocloridria gástrica, hipomotilidade e hipotonia intestinais, deficiências imunológicas, etc., associados a condições ambientais insalubres, altamente contaminados devido a ausência de água potável e saneamento básico, propiciam o sobrecrescimento bacteriano e acarretam sérias conseqüências para o hospedeiro.

Bactérias intestinais, em especial as anaeróbias, atuam sobre os sais biliares primários, desconjugando-os, acarretando diminuição da concentração micelar crítica, impedindo a formação da micela mista. Como decorrência direta deste efeito ocorre deficiente solubilização dos gorduras da dieta, com conseqüente esteatorréia. Estas bactérias também possuem a capacidade de atuar sobre os sais biliares primários porvocando 7 alfa desidroxilação (Figura 6), transformando-os em sais biliares secundários, o que irá desencadear graves alterações morfo-funcionais no intestino delgado.

Figura 6- Representação esquemática da ação das bactérias anaeróbias sobre os sais biliares primários causando 7 alfa desidroxilação e desconjugação, transformando-os em sais biliares secundários.

Além disso, a associação dos sais biliares secundários e desconjugados com as bactérias anaeróbias presentes na luz do intestino delgado é altamente lesiva para a mucosa jejunal acarretando graves deficiências digestivo-absortivas que irão trazer repercussões indesejáveis para a saúde do indivíduo afetado por esta síndrome.

Em conclusão, absorção aumentada de macromoléculas protéicas intactas, potencialmente antigênicas, como foi observado nas condições definidas por este experimento, deve alertar para a possibilidade do aparecimento de alergia alimentar devido à ruptura da barreira de permeabilidade intestinal, mesmo levando-se em conta todas as reconhecidas possiveis limitações advindas de um estudo experimental e suas respectivas dificuldades de transposição para aquela vivenciada na atividade clínica.

No nosso próximo encontro discutirei com riqueza de detalhes as principais implicações clínicas que estas alterações fisiopatológicas, aqui demonstradas, tem provocado nos seres humanos.